PET降解酶PET-mh29/124/183突变体及其编码基因、工程菌和应用的制作方法

本发明涉及酶工程，具体涉及一种pet降解酶pet-mh29/124/183突变体及其编码基因、工程菌和应用。

背景技术：

1、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)俗称涤纶树脂，是热塑性聚酯中最主要的品种，属于五大工程塑料之一。pet在较宽的温度范围内具有优良的耐化学性强、热稳定性和物理机械性能，抗冲击强度比较高，耐折性好，且密度小，易于加工和使用，目前已广泛应用于包装材料、绝缘材料、电子电器等诸多领域。然而在pet大量而广泛应用的同时，pet材料的废弃品也随之大量产生。由于pet在自然环境中难以降解，导致其引发的污染问题日趋严重，既严重危害自然环境，还会给动物和人带来极大的安全和健康威胁。

2、目前回收pet废弃品的方法主要包括物理回收和化学回收，但回收过程仍会对环境造成二次污染，并需要在回收过程中消耗大量能源和资源。生物降解法通过酶或微生物将pet降解成单体分子对苯二甲酸(tpa)和乙二醇，不仅对能源和资源的依赖小，而且降解产物单一，易于回收再利用，是一种绿色环保、具有发展潜力的方法。但以生物降解法降解pet存在酶稳定性差、催化效率低等问题。通过生物合成技术，研究人员已得到一些降解pet速度相对较高并能获得tpa单体的pet降解酶，但用这些降解酶降解pet的工艺需要通过高温熔融重结晶和破碎机的微粉化来降低pet的高结晶度和疏水表面对pet酶解的影响，该过程复杂且成本较高。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种pet降解酶pet-mh29/124/183突变体及其编码基因、工程菌和应用，该pet降解酶pet-mh29/124/183突变体具有较高的降解活性，对高结晶度pet也能高效降解，从而能够简化pet降解工艺，降低成本。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种pet降解酶pet-mh29/124/183突变体，该突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质中第29、124和183位的氨基酸共同进行突变而得。

4、氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质对pet降解酶具有良好的降解活性，实验证明，仅对其第29、124和183位氨基酸进行突变所得突变体的性能相对于该蛋白质会获得提升，而对以上3个位点的氨基酸进行突变则能够获得协同效果，所得突变体的活性显著优于对上述3个位点单独进行突变或将其中2个位点进行突变的突变体，对低结晶度和更难降解的高结晶度pet均有较高的降解效率，且tpa和mhet产量高。因此本发明提供的pet降解酶pet-mh29/124/183突变体可用于不同结晶度pet的规模转化和单体回收。

5、结合第一方面，优选将第29位的氨基酸突变为l-丙氨酸。

6、结合第一方面，优选将第124位的氨基酸突变为s-甘氨酸。

7、结合第一方面，优选将第183位的氨基酸突变为l-酪氨酸。

8、第二方面，本发明还提供上述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体在水解pet中的应用：向80～120mm、ph值为7.5～8.5的磷酸钾缓冲液中加入所述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体至终浓度为5～15μg/ml，在65～75℃，100～220rpm条件下进行pet降解。

9、第三方面，本发明还提供编码pet降解酶pet-mh29/124/183突变体的基因，所述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq idno.3所示。

10、第四方面，本发明还提供含有上述核苷酸序列的重组质粒。

11、第五方面，本发明还提供上述重组质粒的构建方法：以上述核苷酸序列为模板，利用对应引物构建单点突变，先通过pcr反应对目的基因进行指数扩增，然后利用限制性内切酶dpn i去除模板链，利用接着dna连接酶快速环化pcr产物，获得重组质粒。

12、第六方面，本发明还提供用上述重组质粒构建的工程菌。

13、结合第六方面，所述工程菌为大肠杆菌。

14、第七方面，本发明还提供上述工程菌的构建方法：将上述重组质粒转化入bl21(de3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素平板培养基，得到阳性重组子，即为所述工程菌。

15、第八方面，本发明还提供上述工程菌在降解pet中的应用。

16、示例性地，用上述工程菌降解pet的方法可参考如下操作：将上述工程菌在lb液体培养基中培养至od600值达到0.8-1.0范围内，添加诱导剂iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)至浓度0.1～0.15mm，15～17℃诱导表达20～24h；

17、将发酵培养物在离心，用破菌缓冲液吹吸重悬，再次离心，获得含pet降解酶pet-mh29/124/183突变体的粗酶液；将粗酶液进行蛋白纯化后浓缩，作为降解pet的生物催化剂；

18、向待降解的pet薄膜底物，加入pet反应液中，在65-75℃下进行生物催化反应，pet反应液中含有ph＝8.0磷酸钾缓冲液以及降解pet的生物催化剂。

19、本发明的有益效果在于：本发明提供的pet降解酶pet-mh29/124/183突变体具有更高的活性，催化效率高，能够有效地降解不同结晶度的pet废弃物，可用于pet废弃物的资源再生和二次开发，从而缓解生产pet所需的石油资源的压力，解决pet废弃物造成严重的环境污染问题，提高pet的回收价值，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种pet降解酶pet-mh29/124/183突变体，其特征在于，所述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体是将如seq id no.1所示的氨基酸序列中第29、124和183位的氨基酸共同进行突变而得。

2.根据权利要求1所述的pet降解酶pet-mh29/124/183突变体，其特征在于，将第29位的氨基酸突变为l-丙氨酸；和/或

3.权利要求1或2所述的pet降解酶pet-mh29/124/183突变体在水解pet中的应用，其特征在于，向80～120mm、ph值为7.5～8.5的磷酸钾缓冲液中加入所述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体至终浓度为5～15μg/ml，在65～75℃，100～220rpm条件下进行pet降解。

4.编码pet降解酶pet-mh29/124/183突变体的基因，其特征在于，所述pet降解酶pet-mh29/124/183突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

5.含有权利要求4所述核苷酸序列的重组质粒。

6.权利要求5所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，以权利要求4所述核苷酸序列为模板，利用对应引物构建单点突变，先通过pcr反应对目的基因进行指数扩增，然后利用限制性内切酶dpn i去除模板链，利用接着dna连接酶快速环化pcr产物，获得重组质粒。

7.用权利要求6所述的重组质粒构建的工程菌。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌。

9.权利要求8所述的工程菌的构建方法，其特征在于，将权利要求5所述重组质粒转化入bl21(de3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素平板培养基，得到阳性重组子，即为所述工程菌。

10.权利要求7或8所述的工程菌在降解pet中的应用。

技术总结
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种PET降解酶PET‑mh29/124/183突变体及其编码基因、重组质粒、工程菌和应用。本发明提供的PET降解酶PET‑mh29/124/183突变体是将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质中第29、124和183位的氨基酸均进行突变而得，与氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质相比，该突变体对低结晶度和更难降解的高结晶度PET均有较高的降解效率，且TPA和MHET产量高，可用于不同结晶度PET的规模转化和单体回收。本发明还提供了编码该突变体的编码基因以及含有该编码基因的重组质粒和含有该重组质粒的工程菌及其应用。

技术研发人员：齐崴,尤生萍,王梦凡,郑昀欣,林伟,苏荣欣
受保护的技术使用者：源天生物科技（天津）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15