一种SEMA4D人源化小鼠模型的构建方法及其应用与流程

本发明涉及动物基因工程领域，具体涉及一种sema4d人源化小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、近年来肿瘤免疫疗法的概念已经越来越被大众熟知，但新型免疫治疗药物的研发仍面临诸多挑战。由于一般特异性人源蛋白的抗体不能识别小鼠内源蛋白，普通野生型小鼠无法作为测试这些药物的体内模型。而抗小鼠抗体制剂，由于物种特异性限制不能反映同类生物制剂在人体内的实际疗效。这些矛盾阻碍了免疫疗法的临床前评估，限制了新型肿瘤免疫药物研发的快速进展，因此研究者们开始致力于人源化小鼠模型的开发。

2、人源化小鼠是携带功能性人类基因、细胞、组织和/或器官、免疫系统或微生物的小鼠，其主要用于生物医学研究和临床治疗方案的开发。有些人源化小鼠携带人类细胞，有些则与人类具有某些一致的遗传和生理特性。因为小鼠基因组与人类基因组高度相似，且更易于操作和改变，所以小鼠可以方便地模拟人类的生物学特性，用于模拟人类疾病，从而帮助研究者破译致病原理和其分子机制，为药物的开发指引方向。

3、sema4d或cd100是一种来自信号素家族的蛋白质，在血管、神经和免疫系统中具有重要作用，它可以作为膜结合二聚体或作为蛋白水解切割产生的可溶性分子被发现。cd100由包括b淋巴细胞和t淋巴细胞、自然杀伤细胞和骨髓细胞以及内皮细胞在内的大多数造血细胞产生，根据细胞类型和生物体的不同，cd100通过与不同的受体结合发挥作用。细胞间粘附、血管生成、吞噬作用、t细胞启动和抗体产生是该分子许多功能的例子。值得注意的是，已在炎症和传染病中发现高cd100血清水平，但该蛋白质在这些疾病的发病机制中的作用仍有待阐明。cd100在无菌条件下以及动脉粥样硬化、自身免疫、肿瘤发生和抗肿瘤反应等多种疾病中都具有重要作用。

4、cd100属于信号蛋白4类，是所谓的“免疫信号蛋白”之一。已知它参与多种疾病的发病机制，例如动脉粥样硬化和多发性硬化、类风湿性关节炎、脑脊髓炎、多发性骨髓瘤、anca相关血管炎、系统性红斑狼疮和许多其他肿瘤。这些疾病共有的炎症和促血管生成成分表明该分子在免疫系统和内皮细胞功能中的重要作用。实际上，cd100由造血系统的大多数细胞表达，包括淋巴细胞，如b和t淋巴细胞和自然杀伤细胞，以及骨髓细胞（中性粒细胞、血小板和单核细胞）和内皮细胞，其表达通常在激活的t细胞表现出高水平的cd100。除了在膜中表达外，cd100还以可溶形式（scd100）存在，它是通过蛋白水解切割以激活依赖性方式从膜cd100（mcd100）生成的。已知活化的t和b细胞会释放scd100，用t细胞依赖性抗原免疫的小鼠或患有自身免疫性疾病的mrl/lpr小鼠的scd100血清水平升高。

5、人源化小鼠模拟人类疾病，因此通常用于传染病，退行性和癌症疾病的研究。最近的模型还反映了造血，自然免疫，神经生物学和影响疾病病理生物学的分子途径。一系列免疫缺陷小鼠品系允许长寿命的人类祖细胞移植。先天性和适应性免疫的存在使高水平的人血淋巴重构成为可能，细胞对广泛的微生物感染具有敏感性。这些小鼠还有助于研究人类病理生物学，自然疾病过程和广泛人类疾病的治疗效果。因此，利用基因编辑的手段，将编码人类sema4d的基因敲入到其同源balb/c小鼠位点，构建能表达人sema4d细胞因子的小鼠模型在研究免疫治疗、炎症、自身免疫疾病以及筛选评价sema4d靶点药物方面具有较高的应用价值。目前暂未见sema4d人源化小鼠模型构建方法及其在靶点药物应用方面的相关文献报道。

技术实现思路

1、针对目前存在的问题，本发明的第一方面提供一种sema4d人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

2、（1）构建表达人源化sema4d基因的打靶载体，用于人源化sema4d基因的插入；

3、（2）设计针对小鼠sema4d基因翻译起始位点及其后编码区的sgrna，利用体外转录技术获得上述sgrna；

4、（3）将步骤（1）构建的打靶载体、步骤（2）获得的sgrna以及cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性f0小鼠；

5、（4）f0小鼠与背景鼠进行繁殖获得f1小鼠，对f1代鼠尾进行基因鉴定，筛选出sema4d人源化小鼠模型。

6、优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源sema4d的结构及功能，在鼠源sema4d翻译起始密码子（atg）开始插入人源的sema4d基因、鼠源sema4d和3’utr-polya，选取的人源sema4d基因氨基酸序列如seq id no.1所示，被替换的鼠源sema4d基因氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、优选的，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源sema4d基因的1-636aa，利用同源重组的技术替换小鼠sema4d基因的1-636aa，选取的人源sema4d基因序列如seq id no.3所示。

8、优选的，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如seq id no.4所示。

9、更优选的，所述步骤（2）中sgrna的基因序列为seq id no.5和seq id no.6。

10、优选的，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为balb/c。

11、优选的，所述步骤（3）中f0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如seq id no.7和seq id no.8所示，3’端鉴定引物如seq id no.9和seq id no.10所示。

12、优选的，所述步骤（3）中f0小鼠基因型鉴定使用的pcr反应体系如下：

13、。

14、优选的，所述步骤（3）中f0小鼠基因型鉴定使用的pcr反应条件如下：

15、。

16、本发明的第二方面提供上述构建方法得到的小鼠在研究sema4d基因相关功能和作用机制中的应用。

17、优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。

18、本发明的第三方面提供上述构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与sema4d基因相关疾病的药物中的应用。

19、优选的，所述应用是非诊断和非治疗目的的。

20、本发明的有益效果：

21、本发明的动物模型设计了切割鼠源sema4d基因的sgrna，同时设计包含人源sema4d基因的donor，将sgrna、donor和cas9混样，注射到balb/cjgpt背景小鼠的受精卵中，进行同源重组，获得阳性f0，f0小鼠与balb/c小鼠配种获得稳定的遗传阳性f1小鼠模型。本发明构建的能表达人sema4d细胞因子的小鼠模型在研究免疫治疗、炎症、自身免疫疾病以及筛选评价sema4d靶点药物方面具有较高的应用价值。

技术特征：

1.一种sema4d人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：根据人源sema4d的结构及功能，在鼠源sema4d翻译起始密码子（atg）开始插入人源的sema4d基因、鼠源sema4d和3’utr-polya，选取的人源sema4d基因氨基酸序列如seq id no.1所示，被替换的鼠源sema4d基因氨基酸序列如seq id no.2所示。

3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中包括下述步骤：选取人源sema4d基因的1-636aa，利用同源重组的技术替换小鼠sema4d基因的1-636aa，选取的人源sema4d基因序列如seq id no.3所示。

4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中构建成功的打靶载体序列如seq id no.4所示。

5. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中sgrna的基因序列为seq id no.5和seq id no.6。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中提供受精卵的小鼠和假孕小鼠的品系为balb/c。

7. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中f0小鼠基因型鉴定使用的5’端鉴定引物如seq id no.7和seq id no.8所示，3’端鉴定引物如seq id no.9和seqid no.10所示。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中f0小鼠基因型鉴定使用的pcr反应条件如下：

9.权利要求1-8任一项所述的sema4d人源化小鼠模型的构建方法得到的小鼠在研究sema4d基因相关功能和作用机制中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的sema4d人源化小鼠模型的构建方法得到的小鼠在筛选用于治疗与sema4d基因相关疾病的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种SEMA4D人源化小鼠模型的构建方法，该构建方法：（1）构建表达人源化SEMA4D基因的打靶载体；（2）设计并获得针对小鼠Sema4d基因的sgRNA；（3）将打靶载体、sgRNA以及Cas9蛋白共注射或共电转至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，并将该受精卵移植至假孕小鼠，对假孕生仔鼠进行基因型鉴定，筛选成功插入正确人源片段的阳性F0小鼠；（4）F0小鼠与背景鼠配繁获得F1小鼠，筛选出SEMA4D人源化小鼠模型。本发明构建的SEMA4D人源化小鼠在免疫学等领域具有应用价值。

技术研发人员：邢俊,汪慧怡,琚存祥
受保护的技术使用者：江苏集萃药康生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15