一种构建烟雾病类器官模型的方法与流程

本发明涉及生物，更具体地，涉及构建烟雾病类器官模型的方法。

背景技术：

1、烟雾病(moyamoya disease，mmd)是一种病因不明的慢性进展性缺血性脑血管疾病，其特点是双侧颈内动脉末端慢性进行性狭窄或闭塞，脑底出现异常的网状血管；由于脑血管造影下异常网状血管形似烟雾，故称之为烟雾病。

2、目前烟雾病的发病机制研究主要在体外细胞模型上进行，想要进一步探索烟雾病的发病机制和筛选治疗药物必须在更高层级的体内模型中进行。然而烟雾病至今仍没有可靠稳定的动物模型，通过已发现的易感基因进行造模均告失败。因此，亟需一种可靠稳定的动物模型用于探究烟雾病。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种构建烟雾病类器官模型的方法，所述方法包括：

2、获得诱导多功能性干细胞；

3、根据所述诱导多功能性干细胞分化诱导血管谱系分化细胞聚集体，建立血管网与血管类器官模型，所述建立血管网与血管类器官模型的方法包括：

4、每40～60个所述血管谱系分化细胞聚集体与1ml胶原蛋白i–matrigel溶液，并在37℃下培养2h后离心，得到第一沉淀聚集体，向所述第一沉淀聚集体中添加1ml的stempro-34 sfm完全培养液洗涤所述第一沉淀聚集体2次，得到洗涤后的第一沉淀聚集体，将所述洗涤后的第一沉淀聚集体与1ml胶原蛋白i–matrigel溶液，并在37℃下培养2h后离心，得到第二沉淀聚集体，向所述第二沉淀聚集体中添加1ml的stempro-34 sfm完全培养液洗涤所述第二沉淀聚集体2次，得到所述血管网；更换所述stempro-34 sfm完全培养液，直至所述血管网形成血管类器官模型。

5、具体地，所述分化诱导血管谱系分化细胞聚集体的方法包括：

6、将所述诱导多功能性干细胞离心后，获得第一沉淀；

7、将所述第一沉淀进行第一次重悬，获得第一细胞悬浮液；

8、孵育所述第一细胞悬浮液，获得第一细胞聚集体；

9、将所述第一细胞聚集体进行第二次重悬，获得第二细胞悬浮液；

10、孵育所述第二细胞悬浮液，获得第二细胞聚集体；

11、将所述第二细胞聚集体每天快速重悬聚集体一次，共三天；

12、将所述第二细胞聚集体离心，获得第二沉淀；

13、将所述第二沉淀进行三次重悬，得到第三细胞聚集体；

14、孵育所述第三细胞聚集体，获得血管谱系分化细胞聚集体。

15、进一步地，采用浓度为50μm的y-27632聚集培养基进行第一次重悬。

16、进一步地，采用第一混合液进行第二次重悬，所述第一混合液包括：1×n2b27培养基、浓度为12μm的chir99021和浓度为30ng/ml的bmp-4。

17、进一步地，采用第二混合液进行第三次重悬，所述第二混合液包括1×n2b27培养基、浓度为100ng/ml的vegf-a和浓度为2μm的毛喉素。

18、具体地，所述方法还包括：提取外周血单核细胞，以所述外周血单核细胞建立诱导多功能性干细胞系，获得诱导多功能性干细胞。

19、进一步地，采用cytotunetm-ips 2.0仙台病毒重编程试剂盒诱导多功能性干细胞系。

20、进一步地，所述提取外周血单核细胞的方法包括：

21、收集烟雾病患者的外周静脉血8ml置于抗凝管中，并使用ficoll密度梯度离心法获取提取外周血单核细胞。

22、具体地，所述stempro-34 sfm完全培养液包括：浓度为15％的fbs、浓度为100ng/ml的vegf-a和浓度为100ng/ml的fgf-2。

23、进一步地，所述离心的离心力为300g。

24、本发明实施例首次对烟雾病的血管类器官进行建模，制备了一种可靠稳定的动物模型用于探究烟雾病，本发明通过每次取的外周血可以获得多达20组血管类器官系，每组血管类器官可进行传代5次，生产效率和产量大，能够确保机制研究和药物筛选所需类器官的量。最后，本发明建立的血管类器官来源为烟雾病独特个体的外周血，可为独特个体烟雾病的治疗提供个性化和精准医疗方案。

25、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

技术特征：

1.一种构建烟雾病类器官模型的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化诱导血管谱系分化细胞聚集体的方法包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用浓度为50μm的y-27632聚集培养基进行第一次重悬。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用第一混合液进行第二次重悬，所述第一混合液包括：1×n2b27培养基、浓度为12μm的chir99021和浓度为30ng/ml的bmp-4。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用第二混合液进行第三次重悬，所述第二混合液包括1×n2b27培养基、浓度为100ng/ml的vegf-a和浓度为2μm的毛喉素。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：提取外周血单核细胞，以所述外周血单核细胞建立诱导多功能性干细胞系，获得诱导多功能性干细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用cytotunetm-ips2.0仙台病毒重编程试剂盒诱导多功能性干细胞系。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提取外周血单核细胞的方法包括：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述stempro-34 sfm完全培养液包括：浓度为15％的fbs、浓度为100ng/ml的vegf-a和浓度为100ng/ml的fgf-2。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心的离心力均为300g。

技术总结
本发明提供了一种构建烟雾病类器官模型的方法，属于生物技术领域。一种构建烟雾病类器官模型的方法，所述方法包括：获得诱导多功能性干细胞；根据所述诱导多功能性干细胞分化诱导血管谱系分化细胞聚集体，建立血管网与血管类器官模型。本发明实施例首次对烟雾病的血管类器官进行建模，制备了一种可靠稳定的动物模型用于探究烟雾病，本发明通过每次取8mL外周血可以获得多达20组血管类器官系，每组血管类器官可进行传代5次，生产效率和产量大，能够确保机制研究和药物筛选所需类器官的量。最后，本发明建立的血管类器官来源为烟雾病独特个体的外周血，可为独特个体烟雾病的治疗提供个性化和精准医疗方案。

技术研发人员：何世豪,赵元立,王嵘,张钧泽
受保护的技术使用者：何世豪
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15