本发明涉及生物,特别涉及传染性胸膜肺炎apx iv间接elisa方法建立。
背景技术:
1、猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,pcp)是猪的一种高度传染性呼吸道疾病。病猪和隐性感染的猪都有很强的传染性,猪场一旦感染,净化难度大,经济损失严重,最急性型病例没有任何征兆突然死亡,口鼻流出带血的泡沫样分泌物;急性病例厌食,发烧,呼吸窘迫,用口呼吸,以出血性和坏死性胸膜肺炎为特征,死亡率高;慢性病例表现出较轻的症状,死亡率较低,能克服急性疾病的猪仍会受到慢性感染,虽然没有临床症状,但在鼻腔、扁桃体中带有app,成为病原携带者;胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae,app)是一种革兰阴性短杆状细菌,是pcp的重要致病因子。共有16种血清型(荚膜多糖和脂多糖抗原差异),17型(8型)和18型(1型)根据生长是否需要nad分为2种生物型:生物ⅰ型和生物ⅱ型;生物ⅰ型:生长依赖nad,如:血清型1-12,血清型15和16型;生物ⅱ型:生长不依赖nad,如:血清型13-14。属于条件致病菌,不同血清型之间的毒力有明显的差异,不同血清型之间不能产生交叉免疫。
2、毒力因子:包括荚膜多糖(cps)、脂多糖(lps)、外膜蛋白(omp)及溶血外毒素(apx),溶血外毒素(actinobacillus pleuropneumoniae-rtx-toxins,apx)是app重要的毒力因子,其中apxiv最为特殊,其仅在app感染猪时由app所有血清型菌株产生,在体外条件下不产生,并且不会由任何其他细菌产生,自然感染了app的猪体内有针对apxiv的特异性抗体,因此apxiv elisa检测方法被认为是最具特异性的检测方法,apxiv蛋白分子量很大,利用大肠杆菌进行原核表达易形成包涵体,而包涵体的免疫原性较差,因此,对apxiv蛋白进行截短表达,以使其表达在上清,可以有效提高蛋白的免疫原性。
3、防控该病必须采取全面有效的综合防治措施,即从消毒、饲料、饲养管理、引种、免疫接种和药物防治等方面入手。通过控制引种、免疫接种形式是最有效的防控方式,因此,需要一种特异性好、灵敏度高的野毒感染抗体检测试剂盒从源头控制引种app阴性猪,保证后续猪群健康,有利于场区app净化;国内几乎没有可用商品化试剂盒,进口试剂盒因资质及不可抗拒因素,到货困难,且价格昂贵。
4、目前市场上有科前生物、悦洋生物、biostone、idexx、idvet胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒。缺点:
5、1)科前生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差;
6、2)悦洋生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差;
7、3)蛮蛮生物胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒敏感性差;
8、4)idexx胸膜肺炎放线杆菌apxiv间接elisa试剂盒由于无法清关等不可抗拒因素,国内无法购买;
9、5)idvet胸膜肺炎放线杆菌(包被脂多糖蛋白)间接elisa试剂盒与idexx检测结果不一致,无法得到一致的临床结果。
技术实现思路
1、有鉴于此,本发明提供了传染性胸膜肺炎apx iv间接elisa的方法建立,建立了app apxiv野毒抗体检测试剂盒,支撑猪场app疾病原防控和净化,为行业做出贡献。
2、为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
3、本发明提供了蛋白,具有:
4、(1)、如seq id no:3所示的氨基酸序列;或
5、(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列,且功能与(1)的相同或相似;或
6、(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90%同源性的氨基酸序列;所述多个为2个至30个。
7、本发明还提供了核酸分子,具有编码上述蛋白的核苷酸序列。
8、本发明还提供了表达载体,具有编码上述蛋白的核苷酸序列。
9、本发明还提供了宿主细胞,具有上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体中的一种或两种或多种。
10、本发明还提供了上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体在如下任意项中的应用:
11、(i)、检测猪胸膜肺炎放线杆菌;
12、(ii)、检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白;
13、(iii)、制备检测猪胸膜肺炎放线杆菌的试剂或试剂盒;
14、(iv)、制备检测检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白的试剂或试剂盒;
15、所述试剂盒包括检测猪胸膜肺炎放线杆菌apxiv的间接elisa试剂盒。
16、本发明还提供了试剂,包括可接受的辅料或助剂,以及:
17、(a)、上述蛋白;和/或
18、(b)、上述核酸分子;和/或
19、(c)、上述表达载体。
20、本发明还提供了试剂盒,包括上述试剂,以及可接受的辅料或助剂。
21、本发明还提供了装置,包被上述试剂,还包括可接受的部件。
22、本发明还提供了上述试剂盒或上述装置的制备方法,基于上述蛋白、上述核酸分子或上述表达载体制备。
23、本发明还提供了检测方法,包括取上述试剂盒或上述装置检测待测样品,获得检测结果。
24、本发明的试剂或试剂盒及其应用有如下效果:
25、1)特异验试验结果显示,重组抗原与其它病原(放线杆菌、副猪嗜血杆菌、冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、链球菌、支原体等)阳性血清无交叉反应,表现较高的特异性;
26、2)敏感性试验结果显示,在血清稀释度度为1:800表现阳性,建立的间接elisa方法展现较高的敏感性;
27、3)重复性试验结果显示,建立的间接elisa方法批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,具有较好的重复性;
28、4)本发明建立的app毒素4间接elisa检测方法与idexx app毒素4间接elisa抗体试剂盒总符合率达90.79%。而科前生物、蛮蛮生物、悦洋生物阳性检出率低于本发明建立的间接elisa检测方法与idexx app毒素4间接elisa抗体试剂盒,idvet app抗体试剂盒与idexx一致性较差。
1.蛋白,其特征在于,具有:
2.核酸分子,其特征在于,具有编码如权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列。
3.表达载体,其特征在于,具有编码如权利要求1所述的蛋白的核苷酸序列。
4.宿主细胞,其特征在于,具有如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体中的一种或两种或多种。
5.如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体在如下任意项中的应用:
6.试剂,其特征在于,包括可接受的辅料或助剂,以及:
7.试剂盒,其特征在于,包括如权利要求6所述的试剂,以及可接受的辅料或助剂。
8.装置,其特征在于,包被有如权利要求6所述的试剂,还包括可接受的部件。
9.如权利要求7所述的试剂盒或如权利要求8所述的装置的制备方法,其特征在于,基于如权利要求1所述的蛋白、如权利要求2所述的核酸分子或如权利要求3所述的表达载体制备。
10.检测方法,其特征在于,包括取如权利要求7所述的试剂盒或如权利要求8所述的装置检测待测样品,获得检测结果。