一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针及其制备方法

本发明涉及小分子荧光探针，具体地，涉及一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针及其制备方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是动物体内普遍存在的一种蛋白质。仅在脊椎动物中，就已经发现了28种不同类型的胶原蛋白。胶原是多种结缔组织的主要成分，维持着组织和器官的完整结构，并与人体早期发育、器官形成、细胞间的连接、细胞趋化、血小板凝集以及膜的通透性等功能密切相关。胶原产生过多或过少、以及胶原结构的缺陷都可导致疾病。因此，建立有效的检测方法不仅有助于含胶原的生物制品质量控制，而且为深入研究胶原相关疾病提供基础支持。

2、胶原蛋白从结构上分为i型胶原蛋白和ⅱ型胶原蛋白，i型胶原蛋白是由两条α1链(蓝色的链)和一条α2链(灰色的链)组成的异源三聚体分子，ⅱ型胶原蛋白是由3条相同的α1(ⅱ)链构成的同型三聚体超螺旋结构；功能上：i型胶原蛋白通常存在于抵抗拉伸负荷的位置(例如，腱、韧带、皮肤、脉管系统、纤维环、角膜、巩膜和半月板)，ⅱ型胶原蛋白主要分布在软骨、玻璃体中，占成人软骨基质胶原蛋白总量的90％以上。

3、目前对胶原蛋白蛋白质种类的鉴别主要有四种方法，分别是：傅里叶红外光谱检测法、紫外光谱分析法、磷酸缓冲盐溶液检测法以及组织化学染色法。胶原蛋白的含量的检测方法：紫外分光光度法、羟脯氨酸比色法、高效液相色谱法、天狼星红染色法、免疫学检测法。所有方法都存在样品处理过程复杂、精密度灵敏度低及应用范围窄等缺点，上述方法不足之处在于，目前利用荧光分析法鉴别胶原蛋白的种类有限，并且数据前处理较繁琐。

技术实现思路

1、本发明对现有技术中技术样品处理过程复杂，鉴别种类有限的问题，设计制备了一种可定性定量、操作方便、成本低和实时性的荧光探针的制备方法。

2、本发明的目的是这样实现的，一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)将4-羟基二苯甲酮和k2co3加到烧瓶里，倒入乙腈，搅拌1h。将溶于乙腈的1，12-二溴十二烷加到反应瓶中，放入80℃油浴锅中反应过夜。然后将反应液加入到水中淬灭反应，并用二氯甲烷萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去有机溶剂，经柱色谱分离得到提纯产物化合物1。其反应式如下：

4、

5、(2)在n2保护下，将化合物1溶于无水四氢呋喃中，冷却至0℃，缓慢加入ticl4，zn粉，待反应稳定后将反应瓶放入70℃的油浴锅中反应过夜，反应完成后冷却至室温。将反应液加入到10％ na2co3水溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏除去有机溶剂，经柱色谱分离得到提纯产物化合物2。其反应式如下：

6、

7、(3)将化合物2和四甲基乙二胺溶解在氯仿中，将反应瓶放入60℃的油浴锅中反应过夜，反应完成后反应液冷却至室温，减压蒸馏旋干有机溶剂，用无水乙醚洗涤固体，得到产物化合物3。其反应式如下：

8、

9、(4)将化合物3溶于中的乙腈中，加入碘甲烷。在室温下搅拌反应，反应结束后重结晶，离心得到产物1,2-二-(对-(n,n,n,n,n,-五甲基-11,13-十五二碘化季铵盐)苯醚)-1,2-二苯乙烯，即荧光探针tpe-nn。其反应式如下：

10、

11、进一步的，步骤(1)中，所述4-羟基二苯甲酮：1，12-二溴十二烷的摩尔比为1:4；反应温度为80℃；反应时间为12h；洗脱液为乙酸乙酯：石油醚＝1:3(v/v)；

12、进一步的，步骤(2)中，所述反应温度为70-75℃；反应时间为12-14h；洗脱液为二氯甲烷：石油醚＝4:1(v/v)；

13、进一步的，步骤(3)中，所述反应温度为60-65℃，反应时间为12h；

14、进一步的，步骤(4)中，所述化合物3：碘甲烷的摩尔比为1:20；反应温度为80℃；反应时间为12-16h。

15、进一步的，所述减压蒸馏的条件为在40℃水浴温度条件下，负压0.1mpa蒸馏。

16、本发明制备的荧光探针进行检测工作时，将所制备的探针均匀分散于水中，随后加入i型胶原蛋白和ii型胶原蛋白。在室温条件下(20-25℃)取0.1ml混合样品，使用酶标仪进行稳态荧光光谱扫描，其中激发波长为350nm，检测范围为400-600nm。将所得的光谱进行pca分析，对比得出两种胶原蛋白的特征信号。即可实现胶原蛋白的区分。本发明中实现胶原蛋白区分的基础为不同胶原蛋白对于探针具有不同的相互作用力，这些作用力的累计差别可造成制备探针荧光发射光谱的特征信号差异，通过主元素分析法对获得的光谱特征信号进行分析即可区分两种胶原蛋白，荧光分析法是基于荧光探针分子与目标物质相互作用，通过分析作用前后荧光信号的变化来表征目标分析物质的检测方法，该方法具有操作简便、成本低和实时性等特点。

技术特征：

1.一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针，其特征在于，具有如下的结构式：

2.根据权利要求1所述一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述4-羟基二苯甲酮：1，12-二溴十二烷的摩尔比为1:4，反应温度为80℃，反应时间为12h，洗脱液为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯：石油醚＝1:3(v/v)。

4.根据权利要求2所述的一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述反应温度为70-75℃，反应时间为12-14h，洗脱液为二氯甲烷与石油醚的混合液，其中二氯甲烷：石油醚＝4:1(v/v)。

5.根据权利要求2所述的一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述反应温度为60-65℃，反应时间为12h。

6.根据权利要求2所述的一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述化合物3：碘甲烷的摩尔比为1:20；反应温度为80℃；反应时间为12-16h。

7.根据权利要求2所述的一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述减压蒸馏的条件为在40℃水浴温度条件下，负压0.1mpa蒸馏。

技术总结
本发明涉及荧光探针技术领域内一种用于鉴别胶原蛋白的荧光分子探针及其制备方法，本发明制备的荧光探针，涉及小分子荧光探针领域，该分子探针在不同的胶原蛋白溶液中呈现出了不同的荧光响应，通过合理设计检测模型，提取荧光发射光谱的特征值，构建了PCA分析方法，实现了鉴别I型胶原蛋白和II型胶原蛋白，本发明实现胶原蛋白区分的基础为不同胶原蛋白对于探针具有不同的相互作用力，这些作用力的累计差别可造成制备探针荧光发射光谱的特征信号差异，通过主元素分析法对获得的光谱特征信号进行分析即可区分两种胶原蛋白，通过分析作用前后荧光信号的变化来表征目标分析物质的检测方法，该方法具有操作简便、成本低和实时性等优点。

技术研发人员：姚航,施玉凤,吴圣囡,杨晓飞,杨轶,王赪胤,崇辉
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15