一种高效制备14α-羟基孕酮的重组赭曲霉菌株的构建

本发明属于基因工程，具体涉及一种高效制备14α-羟基孕酮的重组赭曲霉菌株的构建。

背景技术：

1、甾体激素类药物因其在甾体母核特定位点引入官能团而具有广泛的生理药理活性，临床上常被用于抗过敏、抗癌以及避孕等方面。

2、14α-羟基甾体化合物具有抗癌、抗炎生物活性和特殊的促性腺激素作用。甾体复杂的化学结构使得传统化学合成方法很难在c14位置实现产率高、选择性好的羟基化反应。而甾体的微生物转化可以对母核结构远端位置的碳位实现区域和立体选择性的羟基化反应并具有反应条件温和的优势，为工业生产提供了方案。

3、目前孕酮的c14位羟化反应是利用新月弯孢霉(curvularia lunata)甾体羟化酶的酶促反应，该方法无法积累14α-羟基孕酮，新月弯孢霉自身产孢性能差且具有潜在的安全风险。相比之下，赭曲霉(aspergillus ochraceus tccc41060)具有良好的甾体羟化活性，具有比新月弯孢霉更强的产孢能力，经crispr-cas9技术改造后的赭曲霉底盘更具应用潜力。

4、从构巢曲霉(aspergillus nidulans)基因组文库中分离出来的ama1序列能够提高转化频率并在丝状真菌中产生表型不稳定的转化体。本发明利用含有ama1序列的质粒载体使目的基因能够高效地转化进赭曲霉原生质体。

技术实现思路

1、实验室前期构建的具有高羟化特异性的14α-羟化酶基因突变体cyp5103b5 d131g为构建新型高效生产14α-羟基孕酮的赭曲霉重组菌提供了基因资源。

2、本发明的技术路线如下：实验室前期鉴定了新月弯孢霉的c14α-羟化酶基因cyp5103b5，通过半理性设计和定点突变技术对其进行定向改造，获得了具有高羟化特异性的突变体d131g以及重组酿酒酵母菌株。为了进一步提高投料量，以改进工艺效率，本发明将c14α-羟化酶基因cyp5103b5 d131g整合在含有ama1序列的载体上，通过原生质体转化的方法将其转入经crispr-cas9编辑cyp68j5功能缺失的赭曲霉中进行异源表达，获得了一种工业高效制备14α-羟基孕酮的赭曲霉重组菌，为c14α-羟化工艺提供了借鉴。其中，羟化酶基因cyp5103b5 d131g受赭曲霉11α-羟化酶基因cyp68j5的orf上游600bp序列启动子的驱动；利用crispr-cas9技术获得cyp68j5功能缺失的赭曲霉底盘步骤如下：

3、(1)确定cas9靶向的cyp68j5基因序列；

4、(2)构建含有两个grna表达盒、一个cas9表达盒以及ama1序列的表达载体pama1-grna-1-2-cas9；

5、(3)将(2)所述重组表达载体通过原生质体转化的方式导入野生赭曲霉进行基因编辑；

6、(4)获得的转化子提取基因组进行测序验证，得到11α-羟化酶基因cyp68j5缺失的赭曲霉底盘；

7、(5)转化子转接至无抗pda试管中培养至产孢，利用无菌水洗涤孢子，稀释涂板；

8、(6)待菌落长出后，将菌落同时对点至潮霉素b 300mg/ml及无抗pda平板筛选得到11α-羟化酶基因cyp68j5缺失且丢掉pama1-grna-1-2-cas9载体的赭曲霉底盘。

9、本发明所述的新月弯孢霉c14α-羟化酶突变体基因cyp5103b5 d131g的核苷酸序列如seq id no.1所示，以上序列属于本发明保护范围。

10、利用本发明所述的编码c14α-羟化酶的基因片段cyp5103b5 d131g所构建的重组表达载体、重组表达质粒或宿主细胞也属于本发明的保护范围，所使用的扩增引物序列也属于本发明的保护范围。

11、本发明所述采用半理性设计和定点突变技术获得的突变体基因cyp5103b5 d131g编码的甾体化合物羟化酶包括但不限于酿酒酵母、赭曲霉等宿主细胞内表达。

12、有益效果：本发明利用crispr-cas9技术对野生赭曲霉进行改造，获得了11α-羟化酶基因cyp68j5失活的赭曲霉底盘，构建含有c14α-羟化酶基因cyp5103b5 d131g和ama1序列的表达载体，通过原生质体转化的方式得到高效制备14α-羟基孕酮的重组赭曲霉。重组赭曲霉羟化特异性提高且投料量达5g/l，本发明研究成果具有很好的工业应用价值。

技术特征：

1.一株重组赭曲霉，其特征在于，利用crispr-cas9技术获得11α-羟化酶基因cyp68j5失活的赭曲霉作为底盘并将seq id no.1所示的cyp5103b5 d131g突变体核苷酸序列构建在含有ama1序列的载体上，通过原生质体转化的方式在赭曲霉底盘中表达。

2.根据权利要求1所述的赭曲霉底盘，其特征在于，改造步骤如下：

3.根据权利要求1所述的cyp5103b5 d131g突变体核苷酸序列，其特征在于，受赭曲霉11α-羟化酶基因cyp68j5的orf上游600bp序列启动子的驱动。

4.根据权利要求1所述的原生质体转化，其特征在于，用于转化的重组质粒均含有ama1序列。

5.根据权利要求1所述的重组赭曲霉，其特征在于，所述重组赭曲霉对孕酮具有14α-羟基化作用，羟化特异性提高且投料量达5g/l。

技术总结
本发明公开了一种高效制备14α‑羟基孕酮的重组赭曲霉菌株的构建，属于基因工程技术领域。发明以11α‑羟化酶CYP68J5缺失的赭曲霉菌株为底盘细胞，异源表达具有高羟化特异性的新月弯孢霉14α‑羟化酶CYP5103B5突变体，获得的重组菌能够以孕酮为底物制备14α‑羟基孕酮，投料量达5g/L，具有工业应用前景。

技术研发人员：刘晓光,何希宏,刘春华,张万庆
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5