一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统与流程

本发明涉及生物，特别是涉及一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统。

背景技术：

1、噬菌体作为一种新型抗菌制剂有许多优势，例如分布广泛、靶向特异性强、副作用小等，在噬菌体制剂的制备过程中，宿主菌被裂解后释放的大量的内毒素，内毒素会刺激人体产生发烧等免疫反应，更严重的会导致休克，所以在噬菌体的大规模生产应用中，如何有效去除内毒素是必须要解决的一大难题。

2、常用的内毒素去除方法主要包括：物理性方法，通过超滤法、密度梯度离心法或活性炭吸附等方法将lps分离；化学性方法，根据lps的化学特性，使用多粘菌素b、脱氧胆酸盐或tritonx-100等解离或清除lps。物理性方法分离效果好，但难以分离大分子lps或与噬菌体结合的lps，且回收率低，过程复杂，对样品、设备、人员有较高要求；化学性方法往往单独使用时效果不理想，不能完全清除lps，去除新引入的溶剂使制备过程更加复杂。目前可通过切向流系统结合氯化铯密度梯度离心快速制备噬菌体制剂，但该方法尚不完备，原因如下：1.引入了毒性有机溶剂，如氯仿和正辛醇；2.实验设备要求高，需要超速离心机，且会引入氯化铯，轻度毒性可能导致低血压、胃肠不适、麻木和晕厥；3.步骤繁琐，需要经过沉淀、透析等步骤；4.制备时间长，从噬菌体粗滤液上清液到获得噬菌体制剂需要较长时间。

3、因此，我们需要开发出一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统，能在短时间内制得内毒素浓度低、噬菌体滴度高的噬菌体制剂，并且所用设备简单，能控制成本，保证方案的普适性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统，以解决上述背景技术中提到的现有制备方法耗时长、设备要求高以及制备过程繁琐等问题。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，所述制备系统包括：

4、三个储液罐，第一储液罐和第二储液罐分别用于存放对噬菌体粗滤液进行处理的脱氧胆酸钠溶液和体积浓度为0.9% nacl溶液，第三储液罐作为样品瓶，用于存放噬菌体粗滤液；

5、切向流超滤膜包，用来对所述噬菌体粗滤液进行超滤；

6、无菌废液罐，用来存放所述噬菌体粗滤液的超滤废液；

7、两个蠕动泵，第一蠕动泵用于将所述脱氧胆酸钠溶液和四次等体积的所述0.9%nacl溶液转移进所述噬菌体粗滤液，第二蠕动泵用于转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤；

8、样品收集管，用来收集制备最终得到的低内毒素噬菌体制剂。

9、进一步地，还包括两个两位三通电磁阀：

10、第一三通阀连接所述第一储液罐和所述第二储液罐、所述样品瓶，用来控制所述脱氧胆酸钠溶液和所述0.9% nacl溶液的转移；

11、第二三通阀连接所述切向流超滤膜包、所述样品收集管和所述样品瓶，用来控制噬菌体超滤液回流进所述样品瓶和收集进所述样品收集管。

12、进一步地，还包括质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量。

13、进一步地，还包括以下连接管道：

14、第一管道，连接所述第一储液罐、所述第二储液罐、所述第一蠕动泵以及所述样品瓶，用作所述脱氧胆酸钠溶液和0.9% nacl溶液从所述第一储液罐和第二储液罐转移进入样品瓶的管路；

15、第二管道，连接所述样品瓶、所述第二蠕动泵、所述切向流超滤膜包以及所述无菌废液罐，用作所述噬菌体粗滤液从所述样品瓶转移进入所述切向流超滤膜包进行超滤的管路和所述超滤废液进入所述无菌废液罐的管路；

16、第三管道，连接所述切向流超滤膜包、所述第二三通阀、所述样品收集管以及所述样品瓶，用作所述噬菌体粗滤液从所述切向流超滤膜包转移进入所述样品瓶的管路和所述低内毒素噬菌体制剂从所述样品瓶经过所述切向流超滤膜包转移进入所述样品收集管的管路。

17、进一步地，还包括操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况。

18、根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，所述方法具体步骤如下：

19、将脱氧胆酸钠溶液存放在所述第一储液罐中，体积浓度为0.9%nacl溶液存放在所述第二储液罐中，噬菌体粗滤液存放在所述样品瓶中，通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述噬菌体粗滤液中加入所述脱氧胆酸钠溶液，使大分子lps解离成小分子lps，通过所述第二蠕动泵转移所述噬菌体粗滤液进所述切向流超滤膜包进行超滤处理；

20、通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述小分子lps的噬菌体粗滤液中补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液，且每次补充后都将所述噬菌体粗滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除lps，得到低内毒素噬菌体滤液；

21、通过控制所述第一三通阀和所述第一蠕动泵，往所述低内毒素噬菌体滤液中补充四次等体积的所述0.9%nacl，且每次补充后都将所述低内毒素噬菌体滤液转移进所述切向流超滤膜包进行超滤去除残留的所述脱氧胆酸钠，得到低内毒素噬菌体制剂。

22、进一步地，所述脱氧胆酸钠溶液的质量浓度为0.25%-2%，所述补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍，所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50；

23、进一步地，所述低内毒素噬菌体制剂中内毒素含量为5 eu/ml及以下，所述低内毒素噬菌体制剂的滴度最高可达所述噬菌体粗滤液中噬菌体滴度的10%-500%。

24、根据本发明的一个方面，提供一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法在制备铜绿假单胞菌噬菌体制剂、大肠杆菌噬菌体制剂、沙门菌噬菌体制剂、鲍曼不动杆菌噬菌体制剂、肺炎克雷伯菌噬菌体制剂、嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体制剂中的应用。

25、由上述技术方案可知，本发明与现有技术相比至少具备以下优点和积极效果：

26、（1）从噬菌体粗滤液到获得低内毒素噬菌体制剂的时间短，大大缩短了低内毒素噬菌体制剂的制备周期；

27、（2）所需引入的溶剂少，只引入脱氧胆酸钠一种溶剂，且可以通过超滤有效去除，最终得到的低内毒素噬菌体制剂中，脱氧胆酸钠残留远低于中国药典要求的浓度；

28、（3）本发明制备得到的低内毒素噬菌体制剂中噬菌体滴度较高，内毒素浓度较低；

29、（4）本发明所用设备简单智能，使用质量感应器，能实时观测噬菌体粗滤液的质量，使用操作显示屏便于操作，能很好地控制噬菌体制剂的质量；

30、（5）本发明制备低内毒素噬菌体制剂的方案成本低，适用性广，易于规模化工业化生产。

技术特征：

1.一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，还包括两个两位三通电磁阀：

3.根据权利要求1所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，还包括质量感应器和内毒素检测器，分别用来检测所述噬菌体粗滤液的质量和内毒素的含量。

4.根据权利要求2所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，还包括以下连接管道：

5.根据权利要求1所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备系统，其特征在于，还包括操作显示屏，用来控制整个系统和显示系统运作情况。

6.一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，包括：

7.根据权利要求6所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，还包括：

8.根据权利要求6所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述脱氧胆酸钠溶液的质量浓度为0.25%-2%。

9.根据权利要求6所述的一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法，其特征在于，所述补充两次等体积的所述脱氧胆酸钠溶液的补液体积为所述噬菌体粗滤液的2-5倍，所述低内毒素噬菌体制剂体积为所述噬菌体粗滤液的1/5-1/50。

10.如权利要求6至9任一项所述的制备方法在制备铜绿假单胞菌噬菌体制剂、大肠杆菌噬菌体制剂、沙门菌噬菌体制剂、鲍曼不动杆菌噬菌体制剂、肺炎克雷伯菌噬菌体制剂、嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体制剂中的应用。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，提供了一种低内毒素噬菌体制剂的制备方法及其制备系统。本方法通过往噬菌体粗滤液中加入脱氧胆酸钠溶液来解离内毒素LPS，通过控制三通阀和蠕动泵，往得到的小分子LPS的噬菌体粗滤液中补充脱氧胆酸钠溶液并超滤去除LPS，补充0.9%NaCl并超滤去除残留的脱氧胆酸钠，得到低内毒素噬菌体制剂，能有效缩短从噬菌体粗滤液到获得噬菌体制剂的时间，并且制备得到的制剂噬菌体滴度高、内毒素含量低，成本低以及适用性广。此外，本发明通过检测单元能实时观测到噬菌体样品的质量和内毒素含量，简单明了，确保制备的噬菌体制剂内毒素低于临床使用标准。

技术研发人员：段湘科,卢洪洲,万小芙,沈佳胤,郑明彬,周泱
受保护的技术使用者：深圳国家感染性疾病临床医学研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16