一种蛋白A/G/C激酶Sch9的突变体、重组毕赤酵母及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种蛋白a/g/c激酶sch9的突变体、重组毕赤酵母及其构建方法和应用。

背景技术：

1、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统，它具有操作简便、易于培养、生长迅速，外源蛋白表达量高、生产成本低等优点。此外，巴斯德毕赤酵母表达系统还可以利用甲醇诱导醇氧化酶来控制外源基因的表达，并且巴斯德毕赤酵母的生长快速，适合于高密度培养，同时巴斯德毕赤酵母作为一种真核细胞生物，可以对翻译后的蛋白进行加工，使来源于真核生物外源蛋白得到正确的折叠和修饰，而巴斯德毕赤酵母表达系统已有20多年的研究开发使用历史，有多种表达载体和改良的宿主菌可供选择，可以进行胞内表达或分泌表达。因此，巴斯德毕赤酵母表达系统的具有很强的实用意义。

2、巴斯德毕赤酵母表达系统广泛地应用于分泌表达来源于人、动物、植物、真菌、细菌及病毒等的重组蛋白。目前已有许多外源基因实现了在巴斯德毕赤酵母的高效分泌表达，表达量能达到克每升的水平。高效表达外源蛋白时，核糖体蛋白的合成会受到抑制，从而减少外源蛋白的合成，减轻翻译负荷。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白时，核糖体蛋白的合成会受到抑制，从而减少外源蛋白的合成，减轻翻译负荷，而提供一种蛋白a/g/c激酶sch9的突变体。

2、本发明的另一目的，提供一种基于所述蛋白a/g/c激酶sch9的突变体的重组巴斯德毕赤酵母。

3、本发明的另一目的，提供一种所述重组巴斯德毕赤酵母的构建方法。

4、本发明的另一方面，提供一种所述重组巴斯德毕赤酵母的应用。

5、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

6、一种蛋白a/g/c激酶sch9的突变体，所述蛋白a/g/c激酶sch9来源于酿酒酵母，所述蛋白a/g/c激酶sch9的突变体sch92d3e为蛋白a/g/c激酶sch9的第723位的苏氨酸突变为天冬氨酸，第726位的甲硫氨酸突变为天冬氨酸，第737位的苏氨酸突变为谷氨酸，第758位的丝氨酸突变为谷氨酸，第765位的丝氨酸突变为谷氨酸。

7、在上述技术方案中，所述突变体sch92d3e的氨基酸序列如seq no.2所示。

8、本发明的另一方面，提供一种重组巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，所述重组巴斯德毕赤酵母分泌所述的蛋白a/g/c激酶sch9的突变体sch92d3e。

9、在上述技术方案中，所述重组巴斯德毕赤酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏号：cgmcc no.26936，保藏日期：2023年3月28日。

10、在上述技术方案中，所述巴斯德毕赤酵母的基因组中重组有表达所述蛋白a/g/c激酶sch92d3e的突变体的dna，所述dna的序列如seq no.1所示。

11、本发明的另一方面，提供一种所述的巴斯德毕赤酵母的构建方法，将表达载体pgapza-sch92d3e线性化后转化巴斯德毕赤酵母构建，优选的，所述蛋白a/g/c激酶sch92d3e的突变体的dna及其调节基因构成的表达盒整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中。

12、在上述技术方案中，所述重组巴斯德毕赤酵母通过以下方法构建：

13、将表达载体pgapza-sch92d3e经单酶切线性化并纯化后电转化巴斯德毕赤酵母感受态细胞，然后进行阳性转化子筛选得到所述重组巴斯德毕赤酵母得到所述重组巴斯德毕赤酵母。

14、在上述技术方案中，所述pgapza-sch92d3e通过以下方法构建：

15、步骤1，为了构建sch92d3e，设计引物p1-p6引入相对应的突变；

16、步骤2，以酿酒酵母的基因组作为模板，引物p1和p2、p3和p4与p5和p6扩增sch9基因的相对应部分，以胶回收纯化后的pcr产物为模板，以引物p1和p6通过pcr扩增sch92d3e基因；

17、步骤3，培养大肠杆菌菌株pgapza、收集细胞，分离、提取质粒pgapza。将步骤2得到的模板用限制性内切酶双酶切后用连接酶与同样双酶切的质粒连接，连接产物化学转化e.coli top10后筛选阳性转化子，阳性转化子提取质粒经鉴定正确后，得到重组质粒pgapza-sch92d3e。

18、本发明的另一方面，提供一种所述的重组巴斯德毕赤酵母在生产分泌型外源蛋白中的应用。

19、在上述技术方案中，所述分泌型外源蛋白为木聚糖酶。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、sch9是酿酒酵母中参与核糖体蛋白合成的一种激酶。sch9通过调控下游途径，调控mrna翻译的起始和延伸、核糖体蛋白合成和trna的合成，从而调控翻译速率。当环境存在压力时，如高温、高盐或氧化压力。其上游因子通过减少磷酸化sch9，从而抑制sch9活性，抑制翻译速率。而sch9的突变体sch92d3e(t723d、s726d、t737e、s758e和s765e)，蛋白可自身实现磷酸化，不受上游蛋白调控，可以持续激活其下游作用因子，使翻译速率不受环境影响，对外源蛋白的表达有着潜在的促进作用。有利于巴斯德毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广发应用。

技术特征：

1.一种蛋白a/g/c激酶sch9的突变体，其特征在于，所述蛋白a/g/c激酶sch9来源于酿酒酵母，所述蛋白a/g/c激酶sch9的突变体sch92d3e为蛋白a/g/c激酶sch9的第723位的苏氨酸突变为天冬氨酸，第726位的甲硫氨酸突变为天冬氨酸，第737位的苏氨酸突变为谷氨酸，第758位的丝氨酸突变为谷氨酸，第765位的丝氨酸突变为谷氨酸。

2.如权利要求1所述的蛋白a/g/c激酶sch9的突变体，其特征在于，所述突变体sch92d3e的氨基酸序列如seq no.2所示。

3.一种重组巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)，其特征在于，所述重组巴斯德毕赤酵母分泌权利要求1-2任意一项所述的蛋白a/g/c激酶sch9的突变体sch92d3e。

4.如权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母，其特征在于，所述重组巴斯德毕赤酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：cgmcc no.26936，保藏日期：2023年3月28日。

5.如权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母的基因组中重组有表达所述蛋白a/g/c激酶sch92d3e的突变体的dna，所述dna的序列如seq no.1所示。

6.一种如权利要求3-5任意一项所述的巴斯德毕赤酵母的构建方法，其特征在于，将表达载体pgapza-sch92d3e线性化后转化巴斯德毕赤酵母构建，优选的，所述蛋白a/g/c激酶sch92d3e的突变体的dna及其调节基因构成的表达盒整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组巴斯德毕赤酵母通过以下方法构建：

8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述pgapza-sch92d3e通过以下方法构建：

9.一种如权利要求3-5任意一项所述的重组巴斯德毕赤酵母在生产分泌型外源蛋白中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述分泌型外源蛋白为木聚糖酶。

技术总结
本发明公开了一种蛋白A/G/C激酶Sch9的突变体、重组巴斯德毕赤酵母及其构建方法和应用，所述蛋白A/G/C激酶Sch9来源于酿酒酵母，所述蛋白A/G/C激酶Sch9的突变体Sch9<supgt;2D3E</supgt;为蛋白A/G/C激酶Sch9的第723位的苏氨酸突变为天冬氨酸，第726位的甲硫氨酸突变为天冬氨酸，第737位的苏氨酸突变为谷氨酸，第758位的丝氨酸突变为谷氨酸，第765位的丝氨酸突变为谷氨酸。Sch9的突变体Sch9<supgt;2D3E</supgt;(T723D、S726D、T737E、S758E和S765E)，蛋白可自身实现磷酸化，不受上游蛋白调控，可以持续激活其下游作用因子，使翻译速率不受环境影响，对外源蛋白的表达有着潜在的促进作用。有利于巴斯德毕赤酵母作为酶制剂生产菌株的广发应用。

技术研发人员：李承,姜睿康,薛怡芸,李振,张天元
受保护的技术使用者：苏州聚维元创生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15