用于检测森林脑炎病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法与流程

本发明涉及生物检测，尤其涉及用于检测森林脑炎病毒的引物组合、试剂盒和psr方法。

背景技术：

1、森林脑炎是由黄病毒属中蜱传脑炎病毒所致的中枢神经系统急性传染病，蜱为其传播媒介。临床上以突起高热、头痛、意识障碍、脑膜刺激征、瘫痪为主要特征，常有后遗症，病死率较高。森林脑炎是森林地区自然疫源性疾病，流行于我国东北和西北的原始森林地区、俄罗斯的远东地区及朝鲜北部林区。有严格的季节性，自5月上旬开始，6月高峰期，7～8月下降，呈散发状态。人群普遍易感，所有患者均有森林作业接触。森林脑炎又称蜱传脑炎(tbe)、俄国春夏季脑炎、东方蜱传脑炎等。

2、该病的病原体属披膜病毒黄病毒属的第四亚群。呈20面体对称，直径为30nm，外包裹网状脂蛋白膜，故呈线球状，内部有包绕蛋白壳体的核心，为单股rna。在发病7日内可从患者脑组织内分离到病原体，也可在其他脏器和体液，如脾、肝、血液、脑脊液、尿液等中检出，但阳性率较低。最常用的实验动物是小白鼠和乳鼠，采用脑内接种，也能在鸡胚或细胞培养中生长。病毒对外界因素的抵抗力不强，煮沸立即死亡，加热至60℃10分钟即补灭活，对乙醚、丙酮均敏感。病毒在脑组织中可保存70天，在50％甘油中可保存3个月以上(4℃)，在低温下可保存更久。病后15天约10％患者血清中出现中和抗体，可长期存在。补体结合抗体在感染后1个月始出现，半年后明显下降。血凝抑制抗体出现较早，在血清中存在时间较长。

3、森林脑炎病毒常见的检测方法有:生化检测法、免疫检测法、探针法和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)法等，但这些方法具有耗时长，操作复杂，灵敏度较低等缺点。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供用于检测森林脑炎病毒的引物组合、试剂盒和psr方法，以至少解决现有技术存在的耗时长、灵敏度较低的问题。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、第一方面，本发明提供了一种用于检测森林脑炎病毒的引物组合，所述引物组合的具体引物序列如下：

4、tbev2-ft：gctcgagatggccatgtggag–gcctactacccggagacac，seq id no.5；

5、tbev2-bt：gctcgagatggccatgtggag-tgtgagatttgcctcccctt，seq id no.6；

6、tbev2-if：cctttatggctgatgcaaggg，seq id no.7；

7、tbev2-ib：aagctcggtcacagagctgaa，seq id no.8。

8、第二方面，本发明提供了上述的引物组合在制备检测森林脑炎病毒的产品中的应用。

9、第三方面，本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒。

10、结合第三方面，在一些实施方式中，所述试剂盒还包括2×psr反应缓冲液、双指示系统和阳性对照。

11、结合第三方面，在一些实施方式中，所述2×psr反应缓冲液含有下列组分：20mmph 8.8的tris-hcl，10mm kcl,10mm(nh4)2so4，0.1％ triton x-100，0.8m甜菜碱,8mmmgso4。

12、结合第三方面，在一些实施方式中，所述双指示系统包括显色液和/或荧光染料；所述显色液包括0.08mm甲酚红和0.02mm苯酚红；所述荧光染料为sybr green i或evegreen。

13、第四方面，本发明提供了一种不以诊断为目的的用于检测森林脑炎病毒的psr方法，包括以下步骤：

14、采用上述的引物组合对待测样品进行psr反应，检测psr反应产物，确定待测样品是否含有森林脑炎病毒。

15、结合第四方面，在一些实施方式中，所述psr反应的反应条件为60-66℃，60min。

16、结合第四方面，在一些实施方式中，所述检测psr反应产物确定待测样品是否含有森林脑炎病毒的方法为：若能扩增，则待测样品含有森林脑炎病毒；若不能扩增，则待测样品不含有森林脑炎病毒。

17、本发明的用于检测森林脑炎病毒的引物组合、试剂盒和psr方法，操作简单，仅需将反应体系置于60-66℃恒温水浴锅中即可完成反应，结果鉴定简便，可通过肉眼观察显色结果，或者通过荧光检测仪、浊度检测仪判断结果；快速、高效扩增，具有灵敏度较高、特异性强等优点，引物组合仅能扩增森林脑炎病毒基因的rna。经试验，本发明的试剂盒用于检测森林脑炎病毒中，敏感性达到了10拷贝/微升

技术特征：

1.用于检测森林脑炎病毒的引物组合，其特征在于，所述引物组合的具体引物序列如下：

2.根据权利要求1所述的引物组合在制备检测森林脑炎病毒的产品中的应用。

3.含有如权利要求1所示引物组合的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×psr反应缓冲液、双指示系统和阳性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述2×psr反应缓冲液含有下列组分：

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述双指示系统包括显色液和/或荧光染料；所述显色液包括0.08mm甲酚红和0.02mm苯酚红；所述荧光染料为sybr green i或evegreen。

7.一种不以诊断为目的的用于检测森林脑炎病毒的psr方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的不以诊断为目的的用于检测森林脑炎病毒的psr方法，其特征在于，所述psr反应的反应条件为60-66℃，60min。

9.根据权利要求8所述的不以诊断为目的的用于检测森林脑炎病毒的psr方法，其特征在于，所述检测psr反应产物确定待测样品是否含有森林脑炎病毒的方法为：若能扩增，则待测样品含有森林脑炎病毒；若不能扩增，则待测样品不含有森林脑炎病毒。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及用于检测森林脑炎病毒的引物组合、试剂盒和PSR方法。本发明用引物组合物对待测样品进行PSR反应，检测PSR反应产物，确定待测样品是否含有森林脑炎病毒。本发明的方法操作简单，仅需将反应体系置于60‑66℃恒温水浴锅中即可完成反应，结果鉴定简便，可通过肉眼观察显色结果，或者通过荧光检测仪、浊度检测仪判断结果；快速、高效扩增，具有灵敏度较高、特异性强等优点，引物组合物仅能扩增森林脑炎病毒基因的RNA。

技术研发人员：刘冰,高志丹,郝永建,宋旭,吴丹丹
受保护的技术使用者：中国人民解放军火箭军特色医学中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15