一种改良的纳米圆盘及其制备方法和应用与流程

本申请涉及生物，尤其涉及一种改良的纳米圆盘及其制备方法和应用。

背景技术：

1、膜蛋白是与细胞膜磷脂双分子层结合的蛋白质，在生命活动中具有重要作用，同时也是重要的药物靶点。而为了解膜蛋白生化反应的机制和设计新的药物靶点，膜蛋白的纯化方法显得尤为重要，由于完整的膜蛋白疏水性较强，在膜裂解过程中容易形成沉淀，复杂的纯化工艺会导致膜蛋白回收率较低，并且膜蛋白本身在天然宿主中会低含量的表达，因此选择不仅能高效提取膜蛋白还能保持膜蛋白分子天然空间结构和理化性质的纯化方法显得十分重要。由于跨膜蛋白具有疏水亲脂的跨膜域，因此必须借助细胞膜的磷脂双分子层这一特殊环境来维持正确结构并保持生物活性，而跨膜次数越多其具有的疏水亲脂跨膜区越多，其在宿主细胞中表达水平越低，这使得制备高纯度膜蛋白的难度越大。而体外制备有活性的跨膜蛋白是目前公认的技术难题，所以正确提取膜蛋白并将膜蛋白组装入类膜环境是至关重要的。

2、传统膜蛋白制备方法是使用去污剂将其从膜上溶解下来，可以保持蛋白稳定性但会影响膜蛋白的功能性和结构完整性等，而现有技术中采用纳米磷脂圆盘(nanodiscs)能够在确定的类膜环境中进行膜蛋白制备和纯化，nanodiscs是一种较为理想的体外类膜体系模型，其含有双层的磷脂结构，因此通过调控磷脂的比例、msp带的长度来精确地调控nanodiscs尺寸的大小。目前制备纳米圆盘第一步是表达和纯化膜支架蛋白(msp)，而msp膜骨架蛋白上存在多组氨酸标签(his-tag)，并且膜蛋白也大部分带his-tag，而目前分离和纯化msp的方法主要使用镍亲和层析，但是msp上his-tag的存在通常会干扰下游纯化，导致最后组装成功之后纯化得到的为蛋白-nanodisc复合物和空载nanodisc纳米盘，因此需要分离空载nanodisc纳米盘，不方便蛋白浓度测定同时也不能知道蛋白精准浓度，使得膜蛋白的纯度较低。由于his标签影响组装后膜蛋白浓度测定，目前主要分离方式是通过酶切msp上his tag，但这样会增加实验步骤，增加工作量的同时还会造成膜蛋白的损失，所以需要寻求其他方法来解决这些问题。

3、因此如何提供一种改良的纳米圆盘，以实现在简单制备纳米圆盘的同时提高膜蛋白组装成功率、膜蛋白的纯度以及膜蛋白的产量，是目前亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请提供了一种改良的纳米圆盘及其制备方法和应用，以解决现有技术中制备纳米圆盘过程中因空载nanodisc纳米盘的存在而使得制备过程繁琐且制备和纯化的膜蛋白纯度低、膜蛋白的损失较多以及组装成功率较低的技术问题。

2、第一方面，本申请提供了一种改良的纳米圆盘，所述纳米圆盘包括优化n端和c端的优化msp蛋白序列，所述优化msp蛋白序列包括msp蛋白、可溶性蛋白和双链球菌标签，所述可溶性蛋白设于所述msp蛋白的n端，所述双链球菌标签序列设于所述msp蛋白的c端。

3、可选的，所述msp蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、可选的，所述可溶性蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；和/或，

5、所述双链球菌标签的氨基酸序列如seq id no.3所示。

6、第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的纳米圆盘的方法，所述方法包括：

7、对所述优化msp蛋白序列进行载体构建，得到重组质粒；

8、向宿主细菌内转化所述重组质粒，以使msp蛋白表达，后进行蛋白纯化，得到高纯度msp蛋白；

9、对所述高纯度msp蛋白进行纳米磷脂圆盘组装，得到纳米圆盘产品。

10、可选的，所述向宿主细菌内转化所述重组质粒，以使msp蛋白表达，后进行蛋白纯化，得到高纯度msp蛋白，包括步骤：

11、向宿主细菌内转化所述重组质粒，并进行培养，得到单菌落；

12、从所述单菌落中挑选单菌斑进行iptg诱导，并进行培养，后进行离心，并取离心沉淀，得到菌体；

13、对所述菌体进行重悬，后进行超声破碎和离心，并收集上清液及沉淀，分别得到上清蛋白液和蛋白沉淀；

14、采用层析介质对所述上清蛋白液进行蛋白纯化，得到高纯度msp蛋白。

15、可选的，所述蛋白纯化包括采用平衡缓冲洗杂、洗脱缓冲和透析缓冲的方式进行蛋白纯化。

16、可选的，所述平衡缓冲洗杂所用溶液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和氯化钠的混合溶液；和/或，

17、所述洗脱缓冲所用溶液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠和生物素的混合溶液；和/或，

18、所述透析缓冲所用溶液包括盐酸和氯化钠的混合溶液。

19、可选的，所述对所述高纯度msp蛋白进行纳米磷脂圆盘组装，得到纳米圆盘产品，包括步骤：

20、采用胆酸钠溶液溶解二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，并进行振荡，得到二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱溶液；

21、混合所述高纯度msp蛋白、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱溶液、聚乙二醇十八烷基醚和磷酸盐缓冲溶液，得到混合溶液；

22、孵育所述混合溶液，后进行透析缓冲和离心，取上清液，得到纳米圆盘产品。

23、可选的，所述高纯度msp蛋白和所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱溶液的摩尔浓度之比为1:150～170。

24、第二方面，本申请提供了一种改良的纳米圆盘，所述纳米圆盘由第一方面所述的制备方法得到，所述纳米圆盘中优化msp蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

25、第三方面，本申请提供了一种改良的纳米圆盘的应用，所述应用包括将第二方面所述的纳米圆盘用于膜蛋白制备和纯化中。

26、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

27、本申请实施例提供的一种改良的纳米圆盘，通过对msp蛋白序列进行优化，在msp蛋白的n端上连接可溶性蛋白，并在msp蛋白的c端上连接双链球菌标签，利用可溶性蛋白提高msp蛋白的水溶性，在重组质粒于宿主细菌内表达过程中，可溶性蛋白的存在可以使得msp蛋白大量表达，从而可以提高纳米圆盘制备出的膜蛋白数量，同时利用双链球菌标签提高msp蛋白在洗脱阶段msp蛋白的亲和性，且不会干扰蛋白纯化的进行，从而可以在蛋白纯化中得到高纯度的msp蛋白，而以msp蛋白为骨架可以构建出组装的纳米圆盘，由于msp蛋白的双链球菌标签与膜蛋白所带多组氨酸标签不一致，因此与膜蛋白组装成功纯化后所产生的空载纳米圆盘较少，可以省略后续对空载纳米圆盘的分离步骤，同时该双链球菌标签不影响后续的纳米圆盘对膜蛋白浓度的测定，可以有效的提高纳米圆盘在制备膜蛋白过程中膜蛋白的组装成功率和膜蛋白的纯度；因此通过上述改良的纳米圆盘可以实现在简单制备纳米圆盘的同时提高膜蛋白组装成功率、膜蛋白的纯度以及膜蛋白的产量。

技术特征：

1.一种改良的纳米圆盘，其特征在于，所述纳米圆盘包括优化msp蛋白序列，所述优化msp蛋白序列包括msp蛋白、可溶性蛋白和双链球菌标签，所述可溶性蛋白设于所述msp蛋白的n端，所述双链球菌标签序列设于所述msp蛋白的c端。

2.根据权利要求1所述的纳米圆盘，其特征在于，所述msp蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示。

3.根据权利要求1所述的纳米圆盘，其特征在于，所述可溶性蛋白的氨基酸序列如seqid no.2所示；和/或，

4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的纳米圆盘的方法，其特征在于，所述方法包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述向宿主细菌内转化所述重组质粒，以使msp蛋白表达，后进行蛋白纯化，得到高纯度msp蛋白，包括步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化包括采用平衡缓冲洗杂、洗脱缓冲和透析缓冲的方式进行蛋白纯化。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述平衡缓冲洗杂所用溶液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和氯化钠的混合溶液；和/或，

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述对所述高纯度msp蛋白进行纳米磷脂圆盘组装，得到纳米圆盘产品，包括步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述高纯度msp蛋白和所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱溶液的摩尔浓度之比为1:150～170。

10.一种改良的纳米圆盘的应用，其特征在于，所述应用包括将如权利要求9所述的纳米圆盘用于膜蛋白制备和纯化中。

技术总结
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种改良的纳米圆盘及其制备方法和应用；所述纳米圆盘包括优化N端和C端的优化MSP蛋白序列，该优化MSP蛋白序列包括MSP蛋白、可溶性蛋白和双链球菌标签，可溶性蛋白设于MSP蛋白的N端，双链球菌标签序列设于MSP蛋白的C端；通过该改良的纳米圆盘可以实现在简单制备纳米圆盘的同时提高膜蛋白组装成功率、膜蛋白的纯度以及膜蛋白的产量。

技术研发人员：柯红,易汪雪,王静,汤碰
受保护的技术使用者：武汉华美生物工程有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15