检测hHSF5基因突变位点的引物、方法、应用及试剂盒

本发明涉及生物医学检测的，具体涉及一种检测hhsf5基因突变位点的引物、方法、应用及试剂盒。

背景技术：

1、遗传因素(基因突变)导致的配子(精子或卵子)发生障碍在不孕不育发生中占比较高。通过探究遗传机制发现，hsf5是一个生殖细胞特异表达的基因。在斑马鱼中敲除hsf5会导致精子数目减少及精子形态异常，以及减数分裂后生精细胞凋亡。这些结果显示，斑马鱼中hsf5在精子发生过程中发挥重要作用。然而，斑马鱼与人类进化上的差异较大，无法从斑马鱼的结果推测其对哺乳动物尤其是人类不孕不育的影响。敲除小鼠中hsf5基因会导致精母细胞完全发育阻滞在粗线期(属于减数第一次分裂前期)，性染色体沉默异常，逆转录转座子line1表达显著上升。以上结果显示，hsf5基因在哺乳动物中的功能与其在斑马鱼中的功能不一致。此外，hsf5蛋白在人和小鼠中高度保守，hsf5基因的功能性突变可能导致人类精子发生阻滞及完全的无精症。因此，检测不孕不育患者体内的致病基因对诊断特发性(hsf5基因异常)不孕不育及靶向治疗具有重要的意义。

2、本试剂盒所涉检测基因补充了不孕不育检测靶点，并明确了特定基因发生突变的潜在位点，同时提供了高特异性检测引物以降低检测脱靶效率，且相对于全基因组外显子检测技术周期短，费用低廉。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种检测hhsf5基因突变位点的引物。

2、本发明的目的之二在于提供一种检测hhsf5基因突变位点的引物的应用。

3、本发明的目的之三在于提供一种检测hhsf5基因突变位点的方法。

4、本发明的目的之四在于提供一种检测hhsf5基因突变位点的试剂盒。

5、本发明实现目的之一所采用的方案是：一种检测hhsf5基因突变位点的引物，包括以下引物对中的至少一种，

6、扩增hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的引物，其碱基序列为：

7、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

8、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

9、扩增hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的引物，其碱基序列为：

10、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

11、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

12、扩增hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的引物，其碱基序列为：

13、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

14、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

15、扩增hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的引物，其碱基序列为：

16、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

17、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

18、扩增hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的引物，其碱基序列为：

19、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

20、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

21、扩增hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的引物，其碱基序列为：

22、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

23、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

24、扩增hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的引物，其碱基序列为：

25、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

26、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg。

27、优选地，还包括测序引物，其碱基序列为：

28、检测hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的测序引物，其碱基序列为：

29、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

30、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

31、检测hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的测序引物，其碱基序列为：

32、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

33、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

34、检测hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

35、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

36、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

37、检测hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

38、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

39、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

40、检测hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

41、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

42、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

43、检测hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

44、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

45、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

46、检测hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的测序引物，其碱基序列为：

47、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

48、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg。

49、本发明实现目的之二所采用的方案是：一种所述的检测hhsf5基因突变位点的引物的应用，将所述引物应用于制备不孕不育诊断产品。

50、本发明实现目的之三所采用的方案是：一种检测hhsf5基因突变位点的方法，包括以下步骤：

51、(1)抽提血液中的基因组dna；

52、(2)用pcr扩增步骤(1)中提取的dna；扩增hhsf5基因中c.a1555g:p.i519v、c.c1337g:p.t445r、c.a449g:p.n150s、c.c514t:p.p172s、c.946_948del:p.316_316del、c.512_514del:p.171_172del、c.t481c:p.s151p突变点序列的引物：

53、扩增hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的引物，其碱基序列为：

54、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

55、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

56、扩增hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的引物，其碱基序列为：

57、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

58、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

59、扩增hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的引物，其碱基序列为：

60、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

61、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

62、扩增hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的引物，其碱基序列为：

63、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

64、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

65、扩增hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的引物，其碱基序列为：

66、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

67、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

68、扩增hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的引物，其碱基序列为：

69、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

70、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

71、扩增hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的引物，其碱基序列为：

72、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

73、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

74、(3)对步骤(2)红的扩增产物进行测序，检测hhsf5基因中c.a1555g:p.i519v、c.c1337g:p.t445r、c.a449g:p.n150s、c.c514t:p.p172s、c.946_948del:p.316_316del、c.512_514del:p.171_172del、c.t481c:p.s151p突变点序列的测序引物的碱基序列为：

75、检测hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的测序引物，其碱基序列为：

76、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

77、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

78、检测hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的测序引物，其碱基序列为：

79、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

80、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

81、检测hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

82、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

83、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

84、检测hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

85、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

86、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

87、检测hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

88、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

89、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

90、检测hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

91、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

92、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

93、检测hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的测序引物，其碱基序列为：

94、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

95、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

96、(4)对测序结果进行判断，确定hhsf5基因位点是否发生突变。

97、本发明实现目的之四所采用的方案是：一种检测hhsf5基因突变位点的试剂盒，包括：

98、(1)血液dna抽提试剂；

99、(2)pcr扩增反应体系试剂；

100、(3)测序体系试剂；

101、其中，pcr扩增反应体系试剂包括：

102、扩增hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的引物，其碱基序列为：

103、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

104、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

105、扩增hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的引物，其碱基序列为：

106、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

107、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

108、扩增hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的引物，其碱基序列为：

109、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

110、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

111、扩增hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的引物，其碱基序列为：

112、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

113、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

114、扩增hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的引物，其碱基序列为：

115、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

116、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

117、扩增hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的引物，其碱基序列为：

118、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

119、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

120、扩增hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的引物，其碱基序列为：

121、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

122、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

123、测序体系试剂包括：

124、检测hhsf5基因c.a1555g:p.i519v突变位点的测序引物，其碱基序列为：

125、f1：aacaagcttcatggtagatattcctctgatcataagtaaatgtttt；

126、r1：ggggactttccttgttgtgagttgcttct；

127、检测hhsf5基因c.c1337g:p.t445r突变位点的测序引物，其碱基序列为：

128、f2：gtaaacctagaggctgtctttcagatagttgatgagt；

129、r2：ctggtgtgtgctgaatggtggcccttcc；

130、检测hhsf5基因c.a449g:p.n150s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

131、f3：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

132、r3：cgtgcggctcgggccggggccccgcgggcggcg；

133、检测hhsf5基因c.c514t:p.p172s突变位点的测序引物，其碱基序列为：

134、f4：cgaggccgagctgctcagcccgcccgggccggggggcggtg；

135、r4：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

136、检测hhsf5基因c.946_948del:p.316_316del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

137、f5：tttgttactgtgtgtgttgttttcaataaataacaccacc；

138、r5：agaattgagaaaacaaagcccattaatccacag；

139、检测hhsf5基因c.512_514del:p.171_172del突变位点的测序引物，其碱基序列为：

140、f6：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

141、r6：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg；

142、检测hhsf5基因c.t481c:p.s151p突变位点的测序引物，其碱基序列为：

143、f7：cggccgcggcgaggggctgcttatcgatcag；

144、r7：agcggccaatgggtccccggcgcctttccgacg。

145、本发明具有以下优点和有益效果：

146、本发明设计了扩增hhsf5基因不同突变位点的不同引物对，采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。本发明能够鉴定包含c.a1555g:p.i519v、c.c1337g:p.t445r、c.a449g:p.n150s、c.c514t:p.p172s、c.946_948del:p.316_316del、c.512_514del:p.171_172del、c.t481c:p.s151p突变位点在内的突变是否存在。本发明仅需要引物设计、提取dna、扩增与跑胶,能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短,易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。