一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法与流程

本发明涉及细胞培养，还涉及重组蛋白生产领域，尤其涉及一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法。

背景技术：

1、hek293细胞，又名人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，常用于外源基因或重组蛋白的表达，具有转染效率高、易于培养等特点。hek293细胞可用于稳定和瞬时基因表达，具有高度可重复性的优点，可高效、批量化生产重组蛋白，已成为生物医药领域的研究热点之一。如公告号为cn115537378b的发明专利，公开一种对hek293细胞进行悬浮培养的方法及其培养基；如公告号为cn114854695b的发明专利，公开一种提高β-2微球蛋白在hek-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法；如公告号为cn113717927b的发明专利，公开一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法；如公告号为cn111304149b发明专利，公开一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用；如公开号为cn111808822a的发明专利，公开细胞培养用补料液及提高重组hek293细胞蛋白表达量的方法；如公开号cn 115747138 a的发明专利，公开一种hek 293细胞培养基及其应用，该培养基在保证hek293细胞高活率，快速生长的同时，能够明显提高瞬转蛋白产量和病毒包装效率的培养基。

2、但是，hek293细胞随着培养周期的延长，会出现细胞活力及健康状况的下降，因而，致使其表达重组蛋白的能力较为有限。如公告号为cn113621577b的发明专利，公开人源化hek293细胞系表达重组蛋白用培养基添加剂、重组乙肝疫苗、表达方法，包括丁酸钠和氢化肉桂酸；重组蛋白表达载体转染hek293细胞，悬浮培养过程中添加所述培养基添加剂；其中丁酸钠添加量为2.0~2.5 mol/l，氢化肉桂酸的添加量为0.6~0.8 mol/l，但当丁酸钠添加量为2.0mol/l、氢化肉桂酸的添加量为0.6mol/l时，hbsag的体积表达量仅为46.34mg/l，当丁酸钠添加量为2.5mol/l、氢化肉桂酸的添加量为0.8mol/l时，hbsag的体积表达量仅为51.49mg/l。因此，如何进一步提高hek293细胞对于重组蛋白的表达量是亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提出一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，以解决hek293细胞的蛋白表达水平较低的问题。

2、基于上述目的，本发明提供了一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

3、s1：配制hek293细胞专用培养基：基础培养基+第一激活剂0.5-10μg/ml+第二激活剂0.1-0.25mg/ml+蛋白保护剂0.1-0.5mg/ml；

4、其中，第一激活剂为akt激活剂sc79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2-0.35):1的质量比混合而成；

5、s2：将重组hek293细胞接种至hek293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%co2、100-160rpm的摇床培养箱中，悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。

6、优选的是，所述基础培养基配方为：dmem/f12培养基+10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）+100ng/ml胰岛素样生长因子1（igf-1）+10ng/ml 白血病抑制因子（lif）+100μm l-抗坏血酸-2-磷酸酯（vc磷酸酯）+100nm皮质醇+1mm n-乙酰半胱胺酸（nac）。

7、优选的是，所述蛋白保护剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖中的一种。

8、优选的是，所述重组hek293细胞的接种密度为0.6×106-1.4×106 cells/ml。

9、优选的是，所述重组hek293细胞为包含乙肝表面抗原序列的表达载体转染hek293细胞。

10、本发明的有益效果：

11、本发明首次以akt激活剂sc79为第一激活剂，以香草酸、三磷酸肌醇复配第二激活剂，二者协同提高hek293细胞对于hbsag基因的表达水平及重组蛋白的表达量。发明人意外地发现，在基础培养基中，仅添加0.5-10μg/ml的akt激活剂sc79，即能明显提升hbsag重组蛋白的表达量，相比于不添加akt激活剂sc79和香草酸、三磷酸肌醇的培养体系，在诱导蛋白生产周期结束时，可将重组hek293细胞活率提高1.83倍，且hbsag重组蛋白的表达量至少提高了181.8%，而相比于不添加akt激活剂sc79但含有香草酸、三磷酸肌醇的培养体系，重组hek293细胞活率也得到了大幅度地提升，且hbsag重组蛋白的表达量至少提高了118.2%，证明了akt激活剂sc79对于hek293细胞生长活率及高效表达hbsag基因具有重要影响。可能的原因是，akt激活剂sc79通过激活akt信号通路，增强了细胞活性，促进hek293细胞中的蛋白质合成，从而提高hbsag重组蛋白的表达，以及促进蛋白质分子在合成过程中的正确折叠和定位，进而提高hek293细胞对重组蛋白的转运及分泌能力；akt激活剂sc79还可能通过调节akt的核转位以及与转录因子的相互作用，从而间接影响hek293细胞中hbsag重组蛋白的转录和表达；akt激活剂sc79对hek293细胞具有一定的保护作用，抑制细胞凋亡和程序性坏死，进而维持hek293细胞活力，提高存活率，并促进hek293细胞增殖。

12、发明人还发现，在基础培养基中引入香草酸、三磷酸肌醇复配的第二激活剂，对于hek293细胞表达hbsag重组蛋白也具有诱导和增效作用。究其原因是，一方面，香草酸可作为抗氧化剂应用于培养基中，有效清除培养基体系的自由基含量，抑制hek293细胞的氧化应激作用，使hek293细胞及dna免受氧化性损伤，进而保护hek293细胞、调控细胞活力，另一方面，香草酸还可能通过激活细胞信号转导途径、调节转录因子活性等，以此正向调控hek293细胞中hbsag基因的表达；而三磷酸肌醇是调控细胞内钙离子通道的重要信号分子，影响hek293细胞对hbsag重组蛋白转运及分泌，进而间接影响hek293细胞对重组蛋白的表达能力。

技术特征：

1.一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，所述基础培养基配方为：dmem/f12培养基+10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/ml胰岛素样生长因子1+10ng/ml 白血病抑制因子+100μm l-抗坏血酸-2-磷酸酯+100nm皮质醇+1mmn-乙酰半胱胺酸。

3.根据权利要求1所述的一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，所述蛋白保护剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，所述重组hek293细胞的接种密度为0.6×106-1.4×106 cells/ml。

5.根据权利要求1所述的一种激活剂促进hek293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，所述重组hek293细胞为包含乙肝表面抗原序列的表达载体转染hek293细胞。

技术总结
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+0.5‑10μg/mL第一激活剂+0.1‑0.25mg/mL第二激活剂+0.1‑0.5mg/mL蛋白保护剂；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2‑0.35):1的质量比混合而成；S2：将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，于37℃、5%CO<subgt;2</subgt;、100‑160rpm条件下，悬浮培养24h后，再于32℃低温诱导培养6d。本发明通过在HEK293细胞培养过程中添加激活剂，有效提高了重组蛋白的表达水平。

技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：思鹏生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16