一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液与检测方法与流程

本发明属于细胞电生理功能检测，涉及一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液与检测方法。

背景技术：

1、心血管疾病的发病率在全球非传染性疾病中居首位，心衰是心血管疾病的头号杀手。目前对心衰的治疗主要是药物和器械方法，其对坏死或失去功能的心肌细胞无治疗作用。而心脏是人体自身再生能力最差的器官之一，其随着年龄的增长再生能力会越来越差。

2、采用体外分化的心肌细胞(比如心肌补片、心肌细胞注射剂、心肌球样细胞)移植到心脏已然成为治疗心衰的新型治疗手段。如2020年5月，南京鼓楼医院王东进团队的一项临床治疗研究得到国际学术期刊《自然》报道，两名男性心衰患者成功接受了基于诱导多能干细胞衍生心肌细胞的治疗，并在随访一年后观察到良好的治疗效果。这是已知的全球首个ips技术治疗心衰的临床应用。同时，国家药监局药品审评中心官网显示，南京艾尔普再生医学科技有限公司自主研发的“人ipsc来源心肌细胞注射液”产品(hicm-188)临床试验申请获得批准，拟用于治疗严重慢性缺血性心力衰竭。

3、体外培养的心肌细胞主要来源于多能干细胞诱导分化，如cn201910014140.7等。但将体外培养的心肌细胞转化为可进行临床应用的心肌细胞产品，必须按照国家药品监督管理评审中心发布的《人源干细胞产品要学研究与评价技术指导原则(试行)》规定，干细胞产品必须进行生物学活性分析，符合成品标准之后才能进行临床应用。心肌细胞的兴奋性，传导性和自律性以心肌细胞的生物电活动为基础，属于电生理特性，因此心肌细胞的生物学活性评价之一：电生理功能评估。

4、目前对心肌细胞进行电生理功能评估主要有：对单个心肌细胞进行动作电位的检测、对心肌细胞单层场电位检测、对心肌细胞的离子通道研究等。

5、但目前这些电生理检测手段主要聚焦于科研方向，在人体内临床的研究处于空白。主要是因为用心肌细胞作为心脏治疗的产品属于前沿产品，现有的心肌细胞研究主要用于类器官模型、疾病的机制研究和药物筛选，这些方向对心肌细胞的电生理需求不需要非常契合人体临床状态。药筛更多的是通过心肌细胞的电生理功能反应研究药物与选择的阳性对照药物是否有更好的治疗效果。

技术实现思路

1、本申请提供一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其有利于保证在进行场电位检测过程中细胞具有较好的状态，以保证电生理功能检测的稳定性。

2、为实现上述技术目，本申请采取的技术方案为：一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，包含无机盐；所述无机盐为含钾离子、钠离子、钙离子和镁离子的盐；各离子的终浓度分别为：钾离子5.3mm-5.4mm、钠离子138mm-162.4mm、钙离子0.8mm-1.8mm、镁离子1.0mm-1.5mm。

3、作为本申请改进的技术方案，各离子的终浓度分别为：钾离子5.4mm、钠离子140mm-150mm、钙离子1.5mm-1.8mm、镁离子1.0mm-1.5mm。

4、作为本申请改进的技术方案，所述钾离子来源于kcl。

5、作为本申请改进的技术方案，所述钠离子来源于nacl、nah2po4、na2co3、nahco3中的一种或任意质量比的多种。

6、作为本申请改进的技术方案，所述钙离子来源于cacl2、ca(no3)2·4h2o中的一种或任意质量比的多种。

7、作为本申请改进的技术方案，所述镁离子来源于mgcl2·6h2o、mgso4中的一种或任意质量比的多种。

8、作为本申请改进的技术方案，还包括：氨基酸，所述氨基酸的用量0mm-11mm，不包含端值0mm；所述氨基酸来源于赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、普胺基酸中的一种或任意质量比的多种。

9、作为本申请改进的技术方案，还包括：维生素；所述维生素的用量为0mm-0.2mm，不包含端值0mm；所述维生素类来源于生物素、氯化胆碱、右旋泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素c、维生素b2、维生素b12、盐酸硫胺、肌醇的一种或任意质量比的多种。

10、作为本申请改进的技术方案，还包括糖类，所述糖类含量9mm-11mm；所述糖类为葡萄糖、乳糖、及糖类代谢产物；所述糖类代谢物为乳酸。

11、作为本申请改进的技术方案，还包括血清或血清替代物；所述血清替代物体积含量0％-10％；所述血清为牛源血清、人血清、牛血清白蛋白、人血白蛋白或植物白蛋白；血清替代物为b27或t3。

12、作为本申请改进的技术方案，所述心肌细胞为心房肌细胞、心室肌细胞和窦房结细胞中的一种或任意数量比的多种。

13、作为本申请改进的技术方案，所述心肌细胞电生理功能检测的时间为自复苏后第5天起进行。

14、作为本申请改进的技术方案，具有用于心肌细胞电生理功能检测的用途，所述心肌细胞电生理功能检测为场电位检测或动作电位检测。

15、本申请的另一目的是提供一种心肌细胞电生理功能检测方法，包括

16、选用场电位检测用电极板；

17、铺设心肌细胞铺板液，并于细胞培养箱中孵育；

18、移除心肌细胞铺板液，并加入心肌细胞复苏液，同时向场电位板的每孔加入心肌细胞悬液，并完成心肌细胞复苏；心肌细胞悬液为细胞分散于心肌细胞复苏液中形成的悬液；

19、去除复苏液，并加入前述的心肌细胞维持培养液；

20、于mea检测仪中监测心肌细胞的场电位。

21、作为本申请改进的技术方案，所述心肌细胞复苏过程保持每天换液、每两天换液或每三天换液。

22、有益效果

23、本申请改变细胞培养液，培养液中离子浓度更接近于人体心脏微环境的浓度，使得心肌细胞具有最接近于临床状态和临床使用的生理活性。本培养基经过方法学验证，从专属性，重复性，准确度上证明，该培养基可以提供有效的场电位数据。

24、本培养液能更真实的反应临床状态心肌细胞电生理特性，便于与临床使用后病人的数据情况进行有效对比分析。

技术特征：

1.一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，包含无机盐；所述无机盐为含钾离子、钠离子、钙离子和镁离子的盐；各离子的终浓度分别为：钾离子5.3mm-5.4mm、钠离子138mm-162.4mm、钙离子0.8mm-1.8mm、镁离子1.0mm-1.5mm。

2.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，各离子的终浓度分别为：钾离子5.4mm、钠离子140mm-150mm、钙离子1.5mm-1.8mm、镁离子1.0mm-1.5mm。

3.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述钾离子来源于kcl。

4.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述钠离子来源于nacl、nah2po4、na2co3、nahco3中的一种或任意质量比的多种。

5.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述钙离子来源于cacl2、ca(no3)2·4h2o中的一种或任意质量比的多种。

6.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述镁离子来源于mgcl2·6h2o、mgso4中的一种或任意质量比的多种。

7.根据权利要求1所述的一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，还包括：氨基酸，所述氨基酸的用量0mm-11mm，不包含端值0mm；所述氨基酸来源于

8.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，还包括：维生素；所述维生素的用量为0mm-0.2mm，不包含端值0mm；所述维生素类来源于生物素、氯化胆碱、右旋泛酸钙、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、维生素c、维生素b2、维生素b12、盐酸硫胺、肌醇的一种或任意质量比的多种。

9.根据权利要求1所述的一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，还包括糖类，所述糖类含量9mm-11mm；所述糖类为葡萄糖、乳糖、及糖类代谢产物；所述糖类代谢物为乳酸。

10.根据权利要求1所述的一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，还包括血清或血清替代物；所述血清替代物体积含量0%-10%；所述血清为牛源血清、人血清、牛血清白蛋白、人血白蛋白或植物白蛋白；血清替代物为b27或t3。

11.根据权利要求1所述一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述心肌细胞为心房肌细胞、心室肌细胞和窦房结细胞中的一种或任意数量比的多种。

12.根据权利要求1所述的一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，所述心肌细胞电生理功能检测的时间为自复苏后第5天起进行。

13.根据权利要求1-12任一所述的一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液，其特征在于，具有用于心肌细胞电生理功能检测的用途，所述心肌细胞电生理功能检测为场电位检测或动作电位检测。

14.一种心肌细胞电生理功能检测方法，其特征在于，包括

15.根据权利要求14所述的一种心肌细胞电生理功能检测方法，其特征在于，所述心肌细胞复苏过程保持每天换液、每两天换液或每三天换液。

技术总结
本发明属于细胞电生理功能检测技术领域，涉及一种适用于心肌细胞电生理功能检测的维持培养液与检测方法，包含无机盐；所述无机盐为含钾离子、钠离子、钙离子和镁离子的盐；各离子的终浓度分别为：钾离子5.3mM‑5.4mM、钠离子138mM‑162.4mM、钙离子0.8mM‑1.8mM、镁离子1.0mM‑1.5mM。其有利于保证在进行场电位检测过程中细胞具有较好的状态，以保证电生理功能检测的稳定性。

技术研发人员：王嘉显,李成武,鲁进平,王倩
受保护的技术使用者：南京艾尔普再生医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15