确定靶多核苷酸的方法和试剂盒，以及探针组与流程

本发明涉及确定样品中靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法。本发明还涉及用于所述方法中的探针组和用于进行所述方法的试剂盒。

背景技术：

1、跨膜孔(纳米孔)作为直接电子生物传感器具有很大的潜力，用于各种分析物，如聚合物和小分子。当跨纳米孔施加电位时，当如多核苷酸等分子瞬时驻留在纳米孔的桶或通道中一段时间时，电流发生变化。特定分子，如特定多核苷酸，给出已知特征和持续时间的电流变化。这种电流变化可以用于识别孔中存在的多核苷酸。

2、跨膜孔可以用于多重测定中以确定一组两种或更多种分析物中每种分析物的存在或不存在。多重测定使用探针组。组中的每个探针包含尾部，所述尾部能够进入孔并影响流过孔的电流和分析物结合区域。每个尾部以不同且独特的方式影响流过孔的电流，这取决于探针是否与感兴趣分析物中的一种结合。组中每个探针对流过孔的电流的影响也是不同的，因此可以检测每个探针的特性。

技术实现思路

1、发明人已经开发了用于使用跨膜孔确定一个或多个靶多核苷酸的存在、不存在、或浓度/量的测定。测定使用探针组，每个探针包括能够与靶多核苷酸杂交的区域和非杂交区域(尾部)。当探针与其靶多核苷酸杂交并与跨其施加电场的跨膜孔接触时，非杂交区域将进入跨膜孔并保持在那里直到靶多核苷酸与探针去杂交。停留时间可以限定为电流阻塞的长度，其中电流阻塞是由于样品中与孔相互作用的组分的存在而使流过孔的离子电流减少。电流阻塞的长度可以限定为样品中的组分引起离子电流减小直到组分不再引起所述电流减小的这种时间之间的时间段。对于给定的孔和电位，停留时间取决于靶多核苷酸在施加电位的力下与探针去杂交所花费的时间。施加电位的强度和孔的尺寸也影响停留时间。

2、发明人已经认识到，可以构建探针组以提供大致相同的停留时间，并且可以用于基于跨膜孔的测定以确定靶多核苷酸的存在、不存在或量。这是特别有利的，例如，当包括靶多核苷酸的样品含有与跨膜孔相互作用的其它组分时。在方法中仅需要分析某些停留时间的电流阻塞。可以从分析排除更长和/或更短的电流阻塞。发明人已经发现，可以通过调节组中一个或多个探针的杂交区域的组成来设计具有大致相同停留时间的探针组。发明人已经发现，可以通过将非天然核苷酸引入杂交区域中来增加或减少探针与其靶多核苷酸保持杂交的时间长度。

3、因此，在一个方面，本发明提供了一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：

4、(i)使所述样品与两个或更多个探针的组在适于所述靶多核苷酸与所述探针杂交的条件下接触，其中：

5、(a)每个探针包括非杂交区域和与所述靶多核苷酸中的一个特异性杂交以形成杂交探针的杂交区域；并且

6、(b)所述组中的探针的所述杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸；

7、(ii)使步骤(i)中制备的所述样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以穿过所述跨膜孔，并且

8、对所述跨膜孔施加电位差，使得所述样品中的所述杂交探针与所述孔相互作用；

9、(iii)测量具有限定窗口内的持续时间的电流阻塞，其中：

10、(a)存在于所述探针的所述杂交区域中的所述一个或多个非天然核苷酸由于所述探针与其靶多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述杂交探针与所述孔的相互作用而在所述窗口内发生的电流阻塞的比例增加；并且

11、(b)每个杂交探针产生指示所述探针的电流阻塞；以及

12、(iv)将所述测量的电流阻塞与所述探针相关联，从而确定所述样品中所述两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。

13、本发明的另外方面包含：

14、-一种诊断疾病的方法，其中所述方法包括执行用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的所述方法，其中所述靶多核苷酸是所述疾病的标志物；

15、-一种两个或更多个探针的组，其在用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中使用；以及

16、-一种本发明的探针组在检测两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法中的用途。

技术特征：

1.一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组中至少两个探针的所述非杂交区域彼此不同，并且所述方法包括单独确定与所述至少两个探针中的每一个杂交的所述靶多核苷酸的存在或不存在。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组中每一个探针包括唯一非杂交区域。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非天然核苷酸包括(ⅰ)经修饰的糖，任选地，其中所述经修饰的糖是2'o-甲基核糖；和/或(ⅱ)经修饰的核碱基。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非天然核苷酸是肽核酸、锁核酸、解锁核酸、桥接核酸(bna)或吗啉代。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述杂交区域中的至少一个包括zxny和/或nyzx中的一个或多个实例，其中z是非天然核苷酸，并且n是与所述靶多核苷酸中的所述核苷酸中的一个互补的天然核苷酸，x是1、2、3、4或5，并且y是1、2、3、4或5。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述探针中的至少一个中，所述非杂交区域是所述杂交区域的5'；和/或其中在所述探针中的至少一个中，所述杂交区域位于所述探针的3'末端处。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针进一步包括第二非杂交区域，以及第二杂交区域、四链体序列或双链区域，其中所述第一和第二非杂交区域由所述第一或第二杂交区域、所述四链体序列或所述双链区域隔开。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非杂交区域包括聚合物；任选地，其中所述聚合物是多核苷酸、多肽、聚乙二醇(peg)或多糖。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针中的一个或多个进一步包括允许其与所述膜偶联的锚。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述窗口被限定为包含0.01秒与10秒之间的电流阻塞。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中由与其各自的靶多核苷酸杂交的所述探针中的至少两个引起的或由所述组中所有杂交探针引起的所述电流阻塞的所述持续时间在彼此的一秒或更短时间内。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是长度为约15个到约30个核苷酸的单链寡核苷酸；任选地，其中所述多核苷酸中的至少一个是sirna或微rna。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述跨膜孔是蛋白质孔或固态孔。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述校准探针的所述杂交区域包括一个或多个非天然核苷酸，所述非天然核苷酸由于所述校准探针与所述校准多核苷酸杂交而增加或减少所述电流阻塞的所述持续时间，使得与所述杂交区域中存在对应的一个或多个天然核苷酸时相比，由于所述杂交校准探针穿过所述孔的移动，在所述窗口内发生的电流阻塞的比例增加。

17.一种诊断疾病的方法，其中所述方法包括执行根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是所述疾病的标志物；任选地，其中所述疾病是癌症、心脏病或传染病。

18.探针组在根据权利要求1-17中任一项所述的方法检测两个或更多个靶多核苷酸的存在或不存在的用途，其中所述探针根据权利要求1-10中任一项定义。

19.一种用于确定两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的试剂盒，包括(a)根据权利要求1-10所述的探针组以及(b)膜锚、(c)校准多核苷酸和(d)校准探针中的一个或多个。

技术总结
一种用于确定在包括额外组分的样品中两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量的方法，所述方法包括：(i)使所述样品与两个或更多个探针的组在适于所述靶多核苷酸与所述探针杂交的条件下接触；(ii)使步骤(i)中制备的所述样品与跨膜孔接触，单链多核苷酸但不是双链多核苷酸可以穿过所述跨膜孔，并且对所述跨膜孔施加电位差，使得所述样品中的所述杂交探针与所述孔相互作用；(iii)测量具有限定窗口内的持续时间的电流阻塞；以及(iv)将所述测量的电流阻塞与所述探针相关联，从而确定所述样品中所述两个或更多个靶多核苷酸的存在、不存在或量。

技术研发人员：尼古拉斯·安东尼·史密斯,丹尼尔·约翰·特纳,丹尼尔·乔治·福德姆,詹姆斯·怀特
受保护的技术使用者：牛津纳米孔科技公开有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15