一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用与流程

本发明属于微生态活菌制品，具体涉及一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用。

背景技术：

1、微生态活菌制品系由人体内正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌经培养，收集菌体、干燥成菌粉后，加入适宜辅料混合制成。微生态活菌制品纳入药品管理，我国最早的微生态活菌制品研发于上世纪50年代，目前中国药典收载了15种可用于生产微生态活菌制品的菌株。微生态活菌制品安全性好，疗效确切，在临床上广泛使用。微生态活菌的作用机理复杂，其中，有益的代谢产物发挥了重要作用，具有改善肠道环境、抑制有害菌、促进有益菌生长等作用。微生态活菌菌株有多重代谢通路可以产生有益代谢产物，但是，由于筛选方式方法的局限性，现有用于商业生产的菌株大多基于最优代谢法则原则，有些通路的部分代谢所需化合物缺失，代谢通路未完全畅通。因此，部分限制了菌株益生作用的发挥。

2、丁酸又名酪酸，是一种短链脂肪酸，它是人肠道上皮细胞的主要营养物质，在小肠中，丁酸是结肠细胞正常生长发育的重要物质，是快速分化细胞的能量源。丁酸用于补充能量可被直接吸收，不需借助胆汁盐的作用。在体内外的研究中已经表明，丁酸对结肠上皮细胞的生长发育具有最显著的作用。研究表明，丁酸可促使小肠吸收面积最大化。此外，体外培养人的大肠黏膜细胞，在没有循环神经因素作用下丁酸钠可直接刺激上皮细胞增殖。另外，以丁酸为代表的短链脂肪酸可刺激结肠吸收钠，从而满足机体贮存水分的需要，维持机体稳态。丁酸还能通过影响肠道 ph值进而影响消化酶的活性。丁酸可调节胃肠道酸度、肠道菌群平衡，刺激结肠有益微生物的生长，抑制不耐酸的弯曲杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌，肠道菌群平衡得到改善。人体内超过95%的丁酸在结肠内产生和吸收，一定水平的丁酸能够使结肠细胞保持稳定，从而可防止或抑制癌变，调节肠道菌群失调和治疗肠易激综合征、抗生素相关性肠炎、急慢性腹泻等疾病。丁酸属于脂肪酸，当通过外界食物摄取时，在其到达大肠发挥作用之前就基本被吸收，因此无法在下消化道中发挥益生作用；而丁酸也是大肠中产丁酸细菌的主要代谢物，因此，大肠中产丁酸微生物对机体健康意义重大。

3、目前尚未有针对为生态活菌制品中的菌株代谢特点，加入代谢通路激活剂，打通特定代谢通路，产生更多益生代谢产物，增强微生态活菌制品益生功能的产品。代谢通路调节剂填补了市场空白，会对微生态活菌制品市场的发展产生积极的推动作用。

技术实现思路

1、针对现有技术中微生态活菌制品代谢通路未完全打开、限制了菌株益生作用的发挥的问题，本发明提供了一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用，通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使现有微生态活菌产品发挥更多的益生效果，起到更好的临床作用效果。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，包括以下步骤：

4、（1）基因组提取：对微生态活菌制品的菌株进行培养、纯化，提取完整基因组；

5、（2）基因序列拼接及序列校正：将基因组测序得到的碱基序列通过无参序列拼接，组成完整的基因组，然后采用序列矫正对测序产生的低质量环化共有序列进行纠错，使所得序列能够完整正确反映目标菌株的实际遗传序列信息，拼接结果为环状基因组，无碎片；

6、（3）基因注释和酶功能注释；

7、（4）代谢通路分析：经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路；丁酸代谢通路的相关基因为丙酮酸合成酶基因（ec 1.2.7.1）、乙酰辅酶a乙酰转移酶基因（ec 2.3.1.9）、羟丁酸辅酶a脱氢酶基因（ec 1.1.1.35）、3-羟基丁基-coa脱水酶基因（ec 4.2.1.150）、丁酰基辅酶a脱氢酶基因（ec 1.3.8.1）、磷酸转丁酸酶基因（ec 2.3.1.19）以及丁酸激酶基因（ec 2.7.2.7）；

8、（5）根据步骤（4）的比对结果确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。

9、进一步地，步骤（1）采用磁珠法提取完整基因组。

10、进一步地，步骤（2）中以二代及三代测序结果互为参考，采用从头测序方法，原始数据通过fastqc进行质量评估，通过trimmomatic对测序数据进行质量剪切，使用spades拼接二代测序数据，采用gapfiller对拼接得到的contig补gap，利用prinses-g修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。

11、进一步地，步骤（3）中采用uniref作为基因注释及酶功能注释的数据库。

12、进一步地，步骤（4）中的代谢通路数据库为京都基因和基因组百科全书和metacyc。

13、进一步地，步骤（4）中获得的丁酸代谢通路的相关化合物包括丙酮酸盐、氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇、coa、乙酰coa、还原铁氧还蛋白[铁硫]、乙酰乙酰coa、3-羟基丁酰基-coa、3-羟基丁酰基-coa、巴豆酰coa、丁酰基coa、氧化的电子转移黄素蛋白+h+、还原的电子转移黄素蛋白、丁酰基磷酸。

14、本发明中，所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法在筛选微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂中的应用。

15、进一步地，所述的微生态活菌制品蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品。

16、进一步地，蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品的丁酸代谢通路激活剂为3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶和/或其产物巴豆酰辅酶a。

17、本发明取得的有益效果为：

18、本发明通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使产品功效得到提升，针对其中一种未打通的有益代谢通路，通过增加调节剂，使通路打开，从而强化了其益生效果。

技术特征：

1.一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1）采用磁珠法提取完整基因组。

3.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中以二代及三代测序结果互为参考，采用从头测序方法，原始数据通过fastqc进行质量评估，通过trimmomatic对测序数据进行质量剪切，使用spades拼接二代测序数据，采用gapfiller对拼接得到的contig补gap，利用prinses-g修正拼接过程中的剪辑错误及小片段的插入缺失。

4.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中采用uniref作为基因注释及酶功能注释的数据库。

5.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中的代谢通路数据库为京都基因和基因组百科全书和metacyc。

6.根据权利要求1所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中获得的丁酸代谢通路的相关化合物包括丙酮酸盐、氧化铁氧还蛋白[铁硫]簇、coa、乙酰coa、还原铁氧还蛋白[铁硫]、乙酰乙酰coa、3-羟基丁酰基-coa、3-羟基丁酰基-coa、巴豆酰coa、丁酰基coa、氧化的电子转移黄素蛋白+h+、还原的电子转移黄素蛋白、丁酰基磷酸。

7.一种权利要求1~6任一项所述的微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法在筛选微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的微生态活菌制品为蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，或其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、蜡样芽孢杆菌活菌片、双歧杆菌四联活菌制剂，以及其他含有蜡样芽孢杆菌的微生态活菌制品，丁酸代谢通路激活剂为3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶和/或其产物巴豆酰辅酶a。

技术总结
本发明公开了一种微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂的筛选方法和应用，属于微生态活菌制品领域。提取完整的微生态活菌制品基因组，并对基因序列拼接及序列校正，获得环状基因组，进行基因注释和酶功能注释，经过基因注释的基因组和酶功能注释与代谢通路数据库比对，对丁酸代谢通路进行分析，获得完整的丁酸代谢通路，确认微生态活菌制品的代谢通路覆盖度，确认相关基因和化合物，即为微生态活菌制品丁酸代谢通路激活剂。本发明通过生物信息学对一种生物标志物代谢通路进行代谢通路的完整性分析，确定关键标志物和基因，采用补加方式补全完善通路，使现有微生态活菌产品发挥更多的益生作用，起到更好的临床治疗效果。

技术研发人员：邢晟,林永强,丁勃,曲见松,徐晓洁,冯丹阳,纪元
受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16