依克多因合成菌株及其构建方法和应用

本发明属于微生物，涉及依克多因合成菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、依克多因，又称四氢嘧啶，是环状氨基酸的衍生物，是一种重要的相容性溶质。依克多因是耐盐微生物中最广泛的相容性溶质，可以帮助生物抵抗高渗透压的胁迫。在已知的相容溶质，例如海藻糖、谷氨酸和甜菜碱中，四氢嘧啶具有很强的细胞保护能力。

2、因其具有长效保湿作用，被广泛应用于化妆品、医药等领域。依克多因是一种比甘油更有效的长效保湿剂，可以通过多种方式减少紫外线和可见光对细胞的伤害，它能够保护皮肤免受氧化损伤，对抗皮肤老化。它也是一种优良的生物功能稳定剂、皮肤保护剂和潜在药物。由于四氢嘧啶在化妆品、医药等领域的广泛应用，每年依克多因的需求量约为1.5万吨，市场规模达数十亿美元，零售价约为1000美元/公斤。

3、目前依克多因的发酵工艺中，有使用野生菌发酵和工程改造菌两种路径。野生菌发酵一般需要高盐环境，对发酵设备的腐蚀较严重，而且产量较低。以大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌为主的工程改造菌已经可以达到较高的产量。对于依克多因发酵，发酵的成本中培养基成本和分离成本都占有不小的比例，而且分离的难易程度会影响得率。目前，大多数报道的培养基需要添加酵母粉、天冬氨酸等高价或者复杂的成分作为氮源，较高的培养基价格和分离成本限制了工业生产的成本。因此目前需要一种能够用成本较低的原料高产依克多因，且杂质较少利于分离的依克多因合成菌株及发酵方法。

技术实现思路

1、本发明的目的第一目的在于提供一株依克多因合成菌株。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株依克多因合成菌株，通过在宿主菌中表达ectabc基因簇获得；所述宿主菌为大肠杆菌(escherichia coli)mg1655；所述ectabc基因簇的核苷酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明的第二目的在于提供上述述菌株的构建方法，包括：

5、扩增ectabc基因簇基因序列，以酶切一步克隆方式插入载体质粒，获得表达质粒；

6、将表达质粒导入宿主菌中，获得所述依克多因合成菌株。

7、作为一种优选的实施方式，所述载体质粒选用ptrc99a质粒。

8、作为一种优选的实施方式，使用如下引物扩增ectabc基因簇基因序列：

9、ectaf：5’-catggaattcgagctcggtaccatgagcacgccaataatacc-3’

10、ectcr：5’-caggtcgactctagaggatccctcaccagtaggtgcggcg-3’。

11、本发明的第三目的在于提供上述菌株在发酵生产依克多因中的应用。

12、作为一种优选的实施方式，所述菌株以氯化铵为唯一氮源发酵生产依克多因。

13、作为一种优选的实施方式，菌株发酵的碳源为葡萄糖、果糖或甘油。

14、作为一种优选的实施方式，菌株发酵的发酵培养基组成为：碳源20-30g/l、氮源6g/l、柠檬酸钠二水合物1g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁1.2g/l，硫酸铁0.1g/l，硫酸锰0.1g/l。

15、作为一种优选的实施方式，使用发酵罐发酵时，通过分批补料补加碳源，保持碳源浓度不超过20g/l；或通过流加补料补加碳源，保持碳源浓度在1-5g/l。

16、作为一种优选的实施方式，使用该菌株发酵产依克多因的方式如下：

17、将所述依克多因合成菌株划线至固体lb培养基，在35-39℃下培养8-16h；

18、挑取培养的菌种，接种至液体lb培养基，在35-39℃下培养8-16h，获得种子液；

19、将种子液接种至发酵培养基，加入氨苄青霉素和iptg诱导剂，在35-39℃下发酵培养36-60h。

20、本发明具有如下有益效果：

21、(1)本发明构建了一株可以使用廉价无机氮源生产依克多因的大肠杆菌，该大肠杆菌在以廉价无机氮源氯化铵为唯一氮源的培养基上可获得最高产量，且发酵液杂质含量较低，提高了发酵效率，降低了分离的难度，能够为工业化生产带来巨大的经济效益。

22、(2)本发明中使用优化的发酵培养基进行分批补料或流加补料发酵，最高可以达到64.66g/l的依克多因产量，产率约为0.20-0.24g/g葡萄糖，且发酵总用时52h，发酵时间短，为菌株工业化合成依克多因提供有利条件。

技术特征：

1.一株依克多因合成菌株，其特征在于，通过在宿主菌中表达ectabc基因簇获得；所述宿主菌为大肠杆菌（escherichia coli）mg1655；所述ectabc基因簇的核苷酸序列如seq idno：1所示。

2.权利要求1所述菌株的构建方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述载体质粒选用ptrc99a质粒。

4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，使用如下引物扩增ectabc基因簇基因序列：

5.权利要求1所述菌株在发酵生产依克多因中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌株以氯化铵为唯一氮源发酵生产依克多因。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，菌株发酵的碳源为葡萄糖、果糖或甘油。

8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，菌株发酵的发酵培养基组成为：碳源20-30g/l、氮源6g/l、柠檬酸钠二水合物1 g/l，磷酸二氢钾2 g/l，硫酸镁1.2 g/l，硫酸铁0.1g/l，硫酸锰0.1 g/l。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，使用发酵罐发酵时，通过分批补料补加碳源，保持碳源浓度不超过20g/l；或通过流加补料补加碳源，保持碳源浓度在1-5g/l。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：

技术总结
本发明涉及依克多因合成菌株及其构建方法和应用，该菌株通过在宿主菌中表达ectABC基因簇获得；所述宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655；所述ectABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的菌株能够使用低价氮源高效合成依克多因，依克多因产量高并且所得发酵液中杂质较少。

技术研发人员：信丰学,姜万奎,冯一帆,章文明,姜岷
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22