一种分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及免疫检测领域，具体为一种分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术：

1、黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补气固表、利尿脱毒，排脓，敛疮生肌等功效。黄芪为常用中药，在中药制剂中以黄芪为君药的产品非常多，因此如何控制黄芪的质量至关重要。黄芪甲苷是黄芪主要有效成分之一，也是黄芪皂苷中具有代表性的单体，在抗衰老、调节免疫功能、保护心肌和大脑缺血等多方面具有显著作用。黄芪甲苷仅在200nm处有末端吸收，对hplc色谱法紫外检测器检测不利，噪音对结果影响较大，灵敏度也较低。2005年版《中国药典》采用蒸发光散射检测器测定，操作繁琐，检测时间较长，价格昂贵，不利于制药公司及基层医疗单位普及。因此研究开发成本低廉、检测迅速、操作简便、灵敏度高的检测技术和产品势在必行。酶联免疫吸附分析法正逐渐应用于中药含量检测，该类方法除具有灵敏、快速、简便的优点外，还有可同时检测多个样品、特异性强等特点。

2、在国内也公开了一些有关黄芪甲苷的检测的专利，例如：公开号为cn116183749a，公开了仁术健胃颗粒中黄芪甲苷的检测方法，仁术健胃颗粒中黄芪甲苷的测定包括以下步骤：步骤1、对照品溶液的制备；步骤2、供试品溶液的制备；步骤3、分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，蒸发光散射检测器测定。本发明建立的检测方法，分析快速、准确，阴性样品没有干扰，有较强的的专属性，良好的重现性和稳定性，所得到的色谱图色谱峰峰型较好，能客观评价仁术健胃颗粒的质量。还有公开号为cn116754667a，提供了一种参芪健胃颗粒质量标准增加含量测定方法，基于高效液相色谱法测定参芪健胃颗粒中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的方法，目的是为了更准确地检测参芪健胃颗粒中有效成分的含量，对药品质量进行严格控制。本方法采用高效液相色谱法，对黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷等有效成分进行分离和检测。此外，本发明还提供了供试品溶液的制备步骤，操作简便，易于理解和实施。本发明具有较高的准确性、良好的灵敏度和广泛的适用性，对药品质量控制具有重要意义，有利于保障药品的安全性和疗效。

3、目前，黄芪甲苷的检测方法主要有紫外分光光度法、薄层扫描法、荧光法和高效液相色谱法、近年来，随着新型检测器的不断出现以及分析检测手段的进步，一些新的方法，如液相-质谱联用分析方法等新方法也用来检测黄芪甲苷药材及制剂中黄芪甲苷含量，但是仪器分析的样品前处理比较繁杂，对操作人员要求较高，仪器本身也很昂贵，这些因素都限制了它的使用范围，酶联免疫分析方法具有高灵敏度、高特异性、操作简单、快速、成本较低等优点、适用于大批量样品的筛选。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了对黄芪甲苷具有较高亲和力和检测灵敏度的黄芪甲苷单克隆抗体，可以用来建立黄芪甲苷的酶联免疫检测方法，为间接竞争elisa试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。从而能快速检测中药药材、黄芪颗粒、黄芪生脉饮等样品中的黄芪含量。

2、本发明的第一个目的是提供一种分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2023年08月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmcc no. 45655。

3、本发明的第二个目的是提供上述分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株在制备黄芪甲苷单克隆抗体中的应用。

4、本发明的第三个目的是提供上述分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株在黄芪甲苷检测中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供黄芪甲苷单克隆抗体，所述黄芪甲苷单克隆抗体是通过上述杂交瘤细胞株分泌得到。

6、本发明的第五个目的是提供上述黄芪甲苷单克隆抗体在黄芪甲苷检测中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种黄芪甲苷检测产品，所述黄芪甲苷检测产品包括上述黄芪甲苷单克隆抗体或上述分泌黄芪甲苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。当然，检测产品可制备成免疫亲和柱、试剂盒、试剂、试纸条等任何形式。

8、进一步，所述黄芪甲苷检测产品为黄芪甲苷酶联免疫检测试剂盒，所述黄芪甲苷酶联免疫检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块酶标板、12瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，其特征在于：酶标板采用的是包被了羊抗鼠的二抗，所述的12瓶试剂分别为6瓶不同浓度的黄芪甲苷标准溶液、1瓶黄芪甲苷酶标记物、1瓶抗体工作液、1瓶显色液、1瓶终止液、1瓶浓缩样本复溶液，1瓶10倍浓缩清洗液，所述试剂瓶都设有相应下凹瓶位，所述抗体工作液的抗体为权利要求3所述的黄芪甲苷单克隆抗体。

9、进一步，所述试剂盒的盒体是硬纸盒，所述酶标板为聚苯乙烯板，放置于真空铝铂袋内，所述不同浓度的黄芪甲苷标准溶液均采用黑色帽的棕色玻璃瓶，所述酶标记物用蓝色帽的白色半透明pe塑料瓶，所述抗体工作液用绿色帽的白色半透明pe塑料瓶，所述显色液用棕色pe塑料瓶，所述终止液用白色帽的半透明白色pe塑料瓶，所述浓缩样本复溶液用白色帽的半透明白色pe塑料瓶，10倍浓缩清洗液用白色帽的半透明白色pe塑料瓶，所述下凹瓶位由塑料泡沫制成。

10、进一步，所述酶标板是包被了羊抗鼠的二抗的聚苯乙烯板，宽度为85mm，长度为126mm，包被液为0.05％碳酸盐缓冲液，所用的封闭液为含有1％bsa的0.01m的磷酸盐缓冲液，所述标准溶液6瓶的容量为2ml／瓶，酶标记物试剂瓶的容量为10ml，抗体工作液试剂瓶的容量为10ml，显色液试剂瓶的容量为15ml，终止液试剂瓶的容量为15ml，浓缩样本复溶液容量为50ml，10倍浓缩清洗液容量为50ml。

11、进一步，所述黄芪甲苷酶联免疫检测试剂盒应用于elisa检测的具体步骤如下：

12、1)清洗液的准备：根据所需量用去离子水将10倍浓缩清洗液按1:9体积比进行稀释，混匀待用；

13、2)取出需要数量的酶标板条插入酶标板架上，并记录各标准品和样品溶液的位置，为减小检测值波动，做双孔平行实验；

14、3)加入标准溶液/样品溶液50μl到对应的微孔中，然后加入酶标记物50μl/孔，抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡5s混匀，盖板后置25℃避光环境中反应10min；

15、4)揭开盖板膜，甩干孔内液体，加入清洗液300μl/孔，洗涤4次，倒掉清洗液，用吸水纸拍干；

16、5)加入底物显色液100μl/孔，混匀，盖板后置于25℃避光环境中反应5min；

17、6)加入终止液100μl/孔，设定酶标仪于450nm处，测定od值；

18、7)检测结果分析：

19、设各标准品溶液浓度的吸光度平均值为b，零标准即浓度为0ug/l的标准品，吸光度平均值b0，以为各标准品溶液对应的吸光度的百分比：使用半对数系统代入标准品对应的吸光度的百分比，与标准品浓度拟合出标准曲线；将待检样品吸光度的百分比代入拟合出的标准曲线方程中，即可得出样品对应的浓度，最后乘以样品相应的稀释倍数，即可得出样品中检测物含量。

20、本发明创造的有益效果是：本发明提供了一种新的合成黄芪甲苷抗原的方法，合成步骤更加简化和方便；通过该抗原免疫动物得到的杂交瘤细胞株以及其分泌的单克隆抗体对黄芪甲苷具有较好的特异性以及检测灵敏度和亲和力，可实现对黄芪含量的检测，为药材中黄芪含量的免疫检测提供了免疫检测方法和原料，具有实际应用价值。

21、黄芪甲苷检测试剂盒是基于竞争酶联免疫吸附检测法其对黄芪甲苷的检测灵敏度高达2ug/l，测定回收率在80-120％之间。

22、黄芪甲苷检测试剂盒结构简单，检测灵敏度高，准确度、精密度检测数据均较好，试剂稳定，全部检测用时只需要30min以内，而一般elisa方法检测单种药物所需时间为60min以上；与传统elisa产品相比可节省成本一半以上，且检测成本低，对检测人员要求低，检测产品便携性好，适用于大批量样品中黄芪甲苷的快速筛查。

23、生物材料保藏

24、黄芪甲苷杂交瘤细胞株，所述黄芪甲苷杂交瘤细胞株已于2023年08月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45655，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。