tRNA及其生物合成方法与流程

本发明涉及trna合成领域，具体而言，涉及一种trna及其生物合成方法。

背景技术：

1、trna是长度在70~120个核苷酸组成的核糖核酸分子，是蛋白质合成中的接合器分子。trna分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核蛋白体上，供蛋白质合成使用。trna的二级结构是倒三叶草的构型，一端有能连接氨基酸的3'-oh结构，另外一端具有反密码子，能与mrna上的密码子碱基互补配对。rna链通过自身回折，互补序列配对形成一段局部的双螺旋，称为茎（stem）或臂（arm）。两段之间未配对的碱基保持单链，形成突环（loop）。茎和突环构成了茎环结构（stem-loop）,也叫发夹结构（hairpin structure）。通常rna回折比例越高，结构越稳定。trna不仅在生命体内发挥着重要作用，同时也有研究证明trna可用于治疗部分由于基因突变导致的疾病，如2021年science上发表的《rnaoverexpression rescues peripheral neuropathy caused by mutations in trnasynthetase》表明基因突变导致的细胞内trna供应不足导致周围神经病变腓骨肌萎缩症。而提高甘氨酰-trna的水平或许有望作为一种潜在的治疗手段。因此trna疗法可能成为未来人类疾病治疗的有效方法。

2、目前rna的合成主要靠固相合成来实现，然而，固定合成rna的长度受限，一般trna的长度为70~120核苷酸，是固相合成不能合成的。目前trna的合成研究极少，主要合成途径来源于胞内的天然trna合成，再通过提取获得trna，产率极低，且过程易受核酸酶污染。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种trna及其生物合成方法，以解决现有技术中难以合成trna产率低的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种trna的生物合成方法，该生物合成方法包括：利用rna连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成trna，底物的数量≥2；rna连接酶包括rna连接酶家族rnl1、rnl2、rnl3和rnl5中任意的一种或多种酶。

3、进一步地，底物中包括一个或/多个非天然核苷酸，trna包括非天然trna。

4、进一步地，rna连接酶包括：seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq idno：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22、或seq id no：23所示的rna连接酶中的一种或多种；或与seq id no：1~ seq id no：6或seq id no：10~seq id no：23中所示的任一种rna连接酶具有70%以上同一性，且具有rna连接酶活性的蛋白。

5、进一步地，非天然rna包括颈环结构和互补区域，底物的连接位点位于非天然trna的颈环结构和/或互补区域。

6、进一步地，底物的3'端为羟基。

7、进一步地，底物包括第一底物和其他底物，第一底物的5'端形成非天然trna的5'端，其他底物的5'端为磷酸。

8、进一步地，底物中的非天然核苷酸的数量≥2。

9、进一步地，底物的5'端和/或3'端的核苷酸为非天然核苷酸。

10、进一步地，底物由非天然核苷酸组成。

11、进一步地，底物的数量为2-6个；底物的长度为15-60 nt。

12、进一步地，生物合成方法包括：底物退火和底物连接；底物退火包括：将底物溶于退火缓冲液中形成退火体系，将退火体系根据退火程序进行退火，退火程序包括：加热退火体系至90℃，保温1min，之后以每分钟0.1℃的降温幅度，降低温度至20℃后温浴10分钟，得到退火产物；底物连接包括：将退火产物、rna连接酶和atp配置为连接体系，进行底物连接。

13、进一步地，退火缓冲液包括：1 mm ~10 m nacl，1 mm~10 m tris-hcl，ph 4~10，0.1 mm ~10 m edta；底物连接的反应温度为0~70℃，反应时间为10 min~100 h；退火产物的浓度为10µm~2mm，rna连接酶的浓度为0.02 ~4mg/ml，atp与退火产物的摩尔比为1~10:1。

14、进一步地，连接体系还包括mgcl2和二硫苏糖醇；其中，mgcl2浓度为0.1 mm ~200m，二硫苏糖醇浓度为0.1 mm ~10 m。

15、进一步地，非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；核糖2'位修饰包括2'-甲氧基修饰、2'-氟修饰、2'-甲氧乙基修饰、2'-fana修饰、锁核酸修饰或己糖醇核酸修饰；核糖骨架修饰包括将核苷酸中的核糖替换为ribulona、tna、tphona、或dxna；碱基修饰包括脱氮腺嘌呤c7修饰、脱氮鸟苷c7修饰、胞嘧啶c5修饰或尿苷c5修饰；磷酸骨架修饰包括ps修饰。

16、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种非天然trna，该非天然trna包括利用上述生物合成方法制备获得的非天然trna。

17、进一步地，上述trna包括利用上述生物合成方法制备获得的非天然trna。

18、应用本发明的技术方案，利用rna连接酶家族rnl1、rnl2、rnl3、rnl5中任意的一种或多种酶，生物合成trna，利用该生物合成方法，能够克服现有技术中trna产率低的问题。

技术特征：

1.一种trna的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成方法包括：

2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物中包括一个或/多个非天然核苷酸，所述trna包括非天然trna。

3.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述rna连接酶包括：

4.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述非天然trna包括颈环结构和互补区域，所述底物的连接位点位于所述颈环结构和/或所述互补区域。

5.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物的3'端为羟基。

6.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物包括第一底物和其他底物，所述第一底物的5'端形成所述非天然trna的5'端，所述其他底物的5'端为磷酸。

7.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物中的非天然核苷酸的数量≥2。

8.根据权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物的5'端和/或3'端的核苷酸为所述非天然核苷酸。

9.根据权利要求8所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物由所述非天然核苷酸组成。

10.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述底物的数量为2-6个；

11.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成方法包括：底物退火和底物连接；

12.根据权利要求11所述的生物合成方法，其特征在于，

13.根据权利要求12所述的生物合成方法，其特征在于，

14.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2'位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；

15.一种trna，其特征在于，所述trna包括利用权利要求1-14中任一项所述的生物合成方法制备获得的所述trna。

16.根据权利要求15所述的trna，其特征在于，所述trna包括利用权利要求2-14中任一项所述的生物合成方法制备获得的所述非天然trna。

技术总结
本发明提供了一种tRNA及其生物合成方法。其中，该tRNA的生物合成方法包括：利用RNA连接酶将不同底物的3'端和5'端连接形成磷酸二酯键，形成tRNA，底物的数量≥2；RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3和Rnl5中任意的一种或多种酶。能够解决现有技术中合成tRNA产率低的问题，适用于tRNA合成领域。

技术研发人员：洪浩,詹姆斯·盖吉,张娜,焦学成,刘芳,马翠萍,庞会宁,贾旭,王召帅,耿宇菡,崔丽心,朱文轩,赵晓岚
受保护的技术使用者：吉林凯莱英医药化学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16