尼卡巴嗪半抗原、人工抗原及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物化工，具体涉及一种尼卡巴嗪半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、关于尼卡巴嗪生理毒性的研究显示，长期摄入超标剂量的尼卡巴嗪，雄鼠的精子畸变率明显增加。长期食用尼卡巴嗪含量超标的鸡肉，会对人体健康造成危害。相关标准规定肉鸡在宰杀前必须要有4天的休药期，许多养殖人员没有严格按照规定执行休药期，导致药物残留含量超标，而超标的鸡肉在外观上与正常的鸡肉无太大区别，消费者无法单靠外观进行辨别。近年来，兽药残留超标事件引起世界各国质检部门的高度重视。部分欧盟国家规定尼卡巴嗪在进口动物源食品中禁止检出；美国食品与药物管理局(fad)规定尼卡巴嗪在进出口动物性食品中禁止检出；国际食品法典委员会(cac)规定禽肌肉、肝脏、皮和肾中尼卡巴嗪最大残留限量为0.2mg/kg，每日允许摄入量为0-400μg/kg；日本动物源性食品标准中，明确规定水产品中尼卡巴嗪中的最高残留限量为20μg/kg；我国2020年发布的《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(gb 31650—2019)中，规定可食用鸡组织(鸡肉、皮脂、肝脏和肾脏)中的最大残留限量为200μg/kg；评价尼卡巴嗪累积效应及作用机制是重要的基础研究，对其相对应的配套检测技术性能也提出更高的要求，快速、准确、高灵敏度和高通量成为发展的趋势。

2、目前对动物源性食品中尼卡巴嗪的检测分析方法研究主要为高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和酶联吸附免疫法。高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法应用较为广泛，检测稳定性较好，但仪器昂贵，将增加基层实验室的运行成本；操作人员要求高，导致人为误差较大。酶联免疫吸附法具有灵敏、特异性强等优点，但其非均相的检测方法需进行分离、洗涤等操作费时长、检测结果易受其他因素干扰、对实验人员操作要求较高。

3、鉴于上述方法存在的不足，本项目将胶体金免疫层析技术应用于尼卡巴嗪的检测，建立快速、简便、灵敏的尼卡巴嗪胶体金免疫层析快速检测技术。胶体金免疫层析法检测鸡肉中尼卡巴嗪不需要依赖大型仪器设备，其操作简便，检测时间短，可直接判读，重复性好。胶体金免疫层析方法已广泛应用于企业质量控制，逐步被国家市场监督管理总局、农业农村部、国家粮食局等官方接受，并上升为行业标准、团体标准，国家推荐标准等，尼卡巴嗪胶体金免疫层析法可广泛适用于基层单位的大面积监督抽查工作和普查工作、养殖企业的自检等，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景，适用于鸡肉组织现场抽样检查。

4、免疫分析检测技术的关键是抗原和抗体的性能决定，而抗原和抗体的关键又是半抗原，因此，要得到性能优异的抗原和抗体，半抗原的结构设计就显得尤为重要。相关技术中基于尼卡巴嗪的本身直接制备得到的人工抗原存在灵敏度差、交叉反应率低的缺陷，无法满足现有市场的实际使用需求。因此，开发高特异性的尼卡巴嗪半抗原或人工抗原对于尼卡巴嗪快速、高灵敏度、低成本检测方法具有至关重要的意义。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种尼卡巴嗪半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、一种尼卡巴嗪半抗原，其为式1所示的结构：

4、

5、一种如上述的尼卡巴嗪半抗原的制备方法，其包括：

6、化合物a和化合物b反应得到化合物c，化合物c水解得到尼卡巴嗪半抗原；

7、其中，化合物a的结构式为：

8、

9、化合物b的结构式为：

10、

11、化合物c的结构式为：

12、

13、进一步地，反应的温度为80-85℃，时间为16-24h。

14、一种尼卡巴嗪人工抗原，其为式2所示的结构：

15、

16、                  

17、其中，protein为蛋白载体。

18、进一步地，蛋白载体选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

19、一种如上述的尼卡巴嗪人工抗原的制备方法，其包括：

20、将尼卡巴嗪半抗原和蛋白质载体连接，得到尼卡巴嗪人工抗原；

21、

22、其中，protein为蛋白载体；

23、蛋白载体选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

24、一种尼卡巴嗪单克隆抗体，其由上述的尼卡巴嗪半抗原或上述的尼卡巴嗪人工抗原得到。

25、一种如上述的尼卡巴嗪单克隆抗体和上述的尼卡巴嗪人工抗原在elisa检测方法中的应用。

26、一种如上述的尼卡巴嗪单克隆抗体和上述的尼卡巴嗪人工抗原在免疫层析中的应用。

27、一种尼卡巴嗪胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其包括如下步骤：

28、(1)氯金酸标记的尼卡巴嗪单克隆抗体的制备：将氯金酸还原后与上述的尼卡巴嗪单克隆抗体结合，离心除杂，加入金保护剂重悬，得到氯金酸标记的尼卡巴嗪单克隆抗体；

29、(2)氯金酸标记的尼卡巴嗪单克隆抗体检测液的制备：用金稀释液将氯金酸标记的尼卡巴嗪单克隆抗体稀释，然后加入到微孔中进行烘干，得到氯金酸标记的尼卡巴嗪单克隆抗体金标微孔；

30、(3)用pbs缓冲液配备系列浓度的尼卡巴嗪标准溶液，取标准溶液滴入尼卡巴嗪单克隆抗体金标微孔中。

31、进一步地，尼卡巴嗪胶体金免疫层析试纸条中的反应膜包被有上述的尼卡巴嗪人工抗原。

32、进一步地，步骤(3)中，肉眼判读t/c线显色深度，当t线显色比c线深或者一样深，则判为阴性，但t线显色比c线浅则判为阳性；或者通过标准溶液加标空白样本，判读结果，实现样本中尼卡巴嗪的快速定性检测。

33、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

34、第一、本发明制备的半抗原不仅完整保留了尼卡巴嗪苯环上的两个硝基端和二苯脲的结构特征，且设计的活性基团直接与苯环相连，使得制备的人工抗原上的尼卡巴嗪小分子结构具备较好的空间结构，更有利于呈现尼卡巴嗪的结构特征，提高了抗原的免疫原性。

35、第二、本发明的尼卡巴嗪人工抗原及单克隆抗体用于elisa检测特异性强，ic50值为0.24μg/l。

36、第三、本发明的尼卡巴嗪人工抗原及单克隆抗体用于胶体金免疫层析技术，可快速、便捷地实现尼卡巴嗪的定性检测，本发明制备的胶体金免疫层析试纸条对尼卡巴嗪在标准溶液中的灵敏度为0.5μg/kg，在样本中的检测灵敏度可达50μg/kg。

技术特征：

1.一种尼卡巴嗪半抗原，其特征在于，其为式1所示的结构：

2.一种如权利要求1所述的尼卡巴嗪半抗原的制备方法，其特征在于，其包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为80-85℃，时间为16-24h。

4.一种尼卡巴嗪人工抗原，其特征在于，其为式2所示的结构：

5.根据权利要求4所述的尼卡巴嗪人工抗原，其特征在于，所述蛋白载体选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

6.一种如权利要求4所述的尼卡巴嗪人工抗原的制备方法，其特征在于，其包括：

7.一种尼卡巴嗪单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的尼卡巴嗪半抗原或权利要求4所述的尼卡巴嗪人工抗原得到。

8.一种如权利要求7所述的尼卡巴嗪单克隆抗体和权利要求4所述的尼卡巴嗪人工抗原在elisa检测方法中的应用；和/或，

9.一种尼卡巴嗪胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述尼卡巴嗪胶体金免疫层析试纸条中的反应膜包被有权利要求4或5所述的尼卡巴嗪人工抗原；和/或，

技术总结
本发明提供了一种尼卡巴嗪半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，化合物a和化合物b反应得到化合物c，化合物c水解得到尼卡巴嗪半抗原，反应的温度为80‑85℃，时间为16‑24h；将尼卡巴嗪半抗原和蛋白质载体连接，得到尼卡巴嗪人工抗原，蛋白载体选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种；尼卡巴嗪单克隆抗体和尼卡巴嗪人工抗原在ELISA检测方法中应用或在免疫层析中的应用；本发明的半抗原不仅完整保留了尼卡巴嗪苯环上的两个硝基端和二苯脲的结构特征，且设计的活性基团直接与苯环相连，使得人工抗原上的尼卡巴嗪小分子结构具备较好的空间结构，更有利于呈现尼卡巴嗪的结构特征，提高了抗原的免疫原性。

技术研发人员：梁俊发,江林峰,叶秋雄,孙覃,易云婷,梁铃渝,张彬彬,胡凌,刘春生,毛新武,刘冬豪,陈佩仪,林嘉健
受保护的技术使用者：广州市食品检验所（广州市酒类检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22