一种鉴别地骨皮的PCR方法与流程

本发明涉及中药鉴定，涉及一种鉴别地骨皮的pcr方法。

背景技术：

1、《中国药典》2020年版对地骨皮进行规定：本品为茄科植物枸杞lycium chinensemill.或宁夏枸杞lycium barbarum l.的干燥根皮。春初或秋后釆挖根部，洗净，剥取根皮，晒干。性甘，寒。归肺、肝、肾经。主治凉血除蒸，清肺降火。用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，肺热咳嗽，咯血，衄血，内热消渴，现代药理学研究表明地骨皮具有解热、降血糖、降血压、免疫调节等作用。根皮类药材外观性状相似，在销售过程中，地骨皮极易与其他常见根皮类药材，如常见的混伪品是其同属植物黑果枸杞(lycium ruthenicum murr.)的干燥根皮。关于黑果枸杞的资料比较少，自古至今的中医中药书籍中鲜有提及，并且《中国药典》中也没有黑果枸杞这一味药材，虽然根据网络上的说法黑枸杞中的花青素可以清除自由基，但是具体是哪方面的作用，资料没有明确记载，因此，准确鉴别地骨皮药材及其混伪品十分必要。

2、目前，中国发明专利申请cn107523639a记载了一种宁夏枸杞与枸杞鉴定用snp特异性引物及其鉴别方法，基于宁夏枸杞与枸杞的snp位点设计特异性引物，经过pcr扩增及电泳检测可对宁夏枸杞与枸杞进行鉴别，但该方法未涉及黑果枸杞的鉴别。另外，中国发明专利申请cn106282390a记载了一种宁夏枸杞和枸杞snp的快速鉴定方法，通过对样品进行pcr扩增和测序，分析序列中snp位点，如果第97位、第173位为c，第200位为g，则鉴定为宁夏枸杞，如果第97位、第173位为t，第200位为a，则鉴定为枸杞，该方法需对pcr产物进行测序和比对分析，耗时较长、过程繁琐，且并未提及黑果枸杞的snp位点。由于以上技术方案并未涉及黑果枸杞的鉴别，且关于地骨皮的掺伪研究文献也鲜有报道，因此，为保障中药用药安全与临床疗效，需要建立准确度高，专属性好，能在短时间内快速鉴别地骨皮基原及其混伪品的分子鉴定方法。

3、有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

1、本申请的一个实施例提供了一种特异性引物对，该引物对能够用于准确检测地骨皮基原是枸杞还是宁夏枸杞，并且能鉴别出是否含有常用掺混品黑果枸杞。本申请实施例的引物对，其包括seq id no.7所示的正向引物和seq id no.8所示的反向引物。

2、本申请的另一个实施例中提供了试剂盒，其包括如上提到的所述的引物对。

3、在其中一些具体实施方式中，所述试剂盒还包括dna提取试剂、pcr扩增试剂和扩增产物检测试剂中的一种或者多种。

4、在其中一些具体实施方式中，所述pcr扩增试剂包括mg2+、dntp、dna聚合酶和pcr缓冲液中的一种或者多种。

5、在其中一些具体实施方式中，所述pcr扩增试剂为pcr预混液，所述pcr预混液包括mg2+、dntp、dna聚合酶和pcr缓冲液。

6、在其中一些具体实施方式中，所述扩增产物检测试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液和凝胶上样缓冲液中的一种或者多种。

7、本申请的还一实施例提供了一种地骨皮的鉴别方法，其包括如下步骤：

8、采用如上提到的所述的引物对对待测样品的基因组dna进行pcr扩增；以及，

9、对所得扩增产物进行检测，根据所得检测结果判断待测样品的种类。

10、在其中一些具体实施方式中，检测的方法采用琼脂糖凝胶电泳法。

11、在其中一些具体实施方式中，根据所得检测结果判断待测样品的种类，包括：

12、若电泳图谱在100bp-150bp处含有2个dna片段条带，则所述待测样品的基原为宁夏枸杞；

13、若电泳图谱在100bp-150bp处含有1个dna片段条带，则所述待测样品的基原为枸杞；

14、若电泳图谱含有98bp的dna片段条带，则所述待测样品含黑果枸杞。

15、在其中一些具体实施方式中，所述待测样品为新鲜中药、药材或者饮片。

16、在其中一些具体实施方式中，pcr扩增满足如下条件中的一个或者多个：

17、(1)每50μl pcr反应体系包括pcr预混液24μl-26μl，引物浓度为8μm-12μm的所述的正、反向引物各0.5μl-0.7μl，dna浓度为20ng/μl-100ng/μl的所述基因组dna 1.8μl-2.2μl；以及，

18、(2)pcr扩增的程序包括：94℃-96℃预变性4min-6min；94℃-96℃变性20s-40s，61℃-62℃退火20s-40s，71℃-73℃延伸20s-40s，共33-35个循环；最后71℃-73℃延伸4min-5min。

19、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

20、本申请提供特异性检测引物对，能够用于准确鉴别地骨皮基原枸杞还是基原宁夏枸杞亦或是常用掺混品黑果枸杞，基于此能构建地骨皮基原的专属性鉴别方法，有效避免饮片在形态上难以鉴别的难题，能在同一个扩增条件下实现地骨皮基原枸杞、宁夏枸杞和常用掺混黑果枸杞的鉴别，提高了鉴别效率。该引物对以及采用该引物对构建的方法适用于新鲜中药、药材及饮片的掺伪及混伪鉴别。

技术特征：

1.引物对，其包括seq id no.7所示的正向引物和seq id no.8所示的反向引物。

2.试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括dna提取试剂、pcr扩增试剂和扩增产物检测试剂中的一种或者多种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述pcr扩增试剂包括mg2+、dntp、dna聚合酶和pcr缓冲液中的一种或者多种；可选地，所述pcr扩增试剂为pcr预混液，所述pcr预混液包括mg2+、dntp、dna聚合酶和pcr缓冲液。

5.根据权利要求3或者4所述的试剂盒，其中，所述扩增产物检测试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液和凝胶上样缓冲液中的一种或者多种。

6.地骨皮的鉴别方法，其包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的地骨皮的鉴别方法，其中，检测的方法采用琼脂糖凝胶电泳法。

8.根据权利要求7所述的地骨皮的鉴别方法，其中，根据所得检测结果判断待测样品的种类，包括：

9.根据权利要求7所述的地骨皮的鉴别方法，其中，所述待测样品为新鲜中药、药材或者饮片。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的地骨皮的鉴别方法，其中，pcr扩增满足如下条件中的一个或者多个：

技术总结
本发明涉及中药鉴定技术领域，涉及一种鉴别地骨皮的PCR方法。该方法涉及如下引物对，其包括SEQ ID NO.7所示的正向引物和SEQ ID NO.8所示的反向引物。相对于传统技术，本申请的有益效果包括：本申请提供特异性检测引物对，能够用于准确鉴别地骨皮基原枸杞、宁夏枸杞和常用掺混品黑果枸杞，基于此能构建地骨皮基原的专属性鉴别方法，有效避免饮片在形态上难以鉴别的难题，能在同一个扩增条件下实现地骨皮基原枸杞、宁夏枸杞和常用掺混黑果枸杞的鉴别，提高了鉴别效率。该引物对以及采用该引物对构建的方法适用于植物、药材及饮片的掺伪及混伪鉴别。

技术研发人员：谭斯尹,潘礼业,兰小勇,钟春琳,吴妙梨,邓立萍,贾小舟,罗宇琴,李国卫,陈向东
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25