敲除油菜Far-RedElongatedHypocotyl3在调控油菜花瓣大小中的应用的制作方法

本发明涉及作物学与农业分子生物学领域，具体涉及敲除油菜far-redelongated hypocotyl 3在调控油菜花瓣大小中的应用。

背景技术：

1、油菜(brassica napus l.)是世界上第三大油料作物，生产的菜籽油约占全球植物油总产量的16％。十字花科植物因为具备十字型花冠的特征，因此被赋予了十字花科的植物学名称，包括349属4060种，是当今最大的开花植物科之一。十字花科植物的花器官最外轮是四个萼片，往内是四个分离的花瓣，花瓣与萼片交替分布，呈现整齐的十字型。在油菜中，花瓣面积与个体节能减耗、群体光能利用以及生态抑病相关，小花瓣性状在这些方面具有优势，在保留花瓣的基础上选育花瓣面积小的品种具有更高的经济价值。

2、因此,寻找一种有效减小油菜花瓣面积的途径意义重大。

技术实现思路

1、本发明提出了油菜中编码一种光信号蛋白的far-red elongated hypocotyl 3(bnafhy3)基因，并公布了其应用方法。其目的是通过基因编辑创制bnafhy3基因的纯合突变体，获得较野生型花瓣变小的植株，从而为油菜分子生物育种提供有效途径。

2、本发明的第一个目的是提供敲除油菜bnafhy3基因在减小油菜花瓣面积中的应用。

3、进一步的，所述应用为同时敲除bnafhy3基因在油菜a01、c01、a05和c05染色体上的4个同源拷贝，所述4个同源拷贝分别为基因bnaa01g0219400we/bnaa01.fhy3、bnaa05g0289800we/bnaa05.fhy3、bnac01g0308000we/bnac01.fhy3和bnac05g0342900we/bnac05.fhy3，获得bnafhy3纯合突变体，基因bnaa01g0219400we/bnaa01.fhy3的核苷酸序列如seq id no.1所示、bnaa05g0289800we/bnaa05.fhy3的核苷酸序列如seq id no.3所示、bnac01g0308000we/bnac01.fhy3的核苷酸序列如seq id no.5所示和bnac05g0342900we/bnac05.fhy3的核苷酸序列如seq id no.7所示。

4、bnaa01g0219400we/bnaa01.fhy3的氨基酸序列如seq id no.2所示、bnaa05g0289800we/bnaa05.fhy3的氨基酸序列如seq id no.4、bnac01g0308000we/bnac01.fhy3的氨基酸序列如seq id no.6和bnac05g0342900we/bnac05.fhy3的氨基酸序列如seq id no.8所示。

5、a01、c01、a05和c05染色体上bnafhy3基因四个同源拷贝编码序列、氨基酸序列比对如图1、2所示，同源基因的进化树以及基因结构如图5a所示。

6、进一步的，利用基因编辑crispr/cas9技术敲除油菜bnafhy3基因。

7、本发明的第二个目的是提供用于敲除油菜bnafhy3基因的载体在减小油菜花瓣面积中的应用。

8、进一步的，所述载体利用基因编辑crispr/cas9技术敲除油菜bnafhy3基因。

9、进一步的，bnafhy3基因的sgrna序列如seq id no.9所示：

10、ggaaggaggaagactttgcg。

11、进一步的，所述载体将所述bnafhy3基因的sgrna序列克隆并构建到patu6-26-m载体，从而得到patu6-26-fhy3；之后利用kpn i和sal i酶将patu6-26-fhy3中的sgrna表达序列结构克隆到pubq10:cas9-p2a-gfp(hyg)载体中。

12、有益效果

13、本发明公开了利用敲除油菜中bnafhy3基因对油菜花瓣大小进行改良的应用。

14、本发明首次通过crispr/cas9技术创制了油菜中同时沉默a01、c01、a05和c05染色体上bnafhy3基因四个同源拷贝的转基因植株bnafhy3纯合突变体，该植株花瓣变小，说明该基因与参与调控油菜中花瓣大小，具有基因工程应用价值。

15、基于本发明发现的bnafhy3基因应用，可以通过crispr/cas9等基因敲除技术对该基因进行编辑，获得纯合的转基因材料，经过pcr验证的纯合突变体可以直接推广应用，大大缩短了小花瓣品种的培育时间。

技术特征：

1.敲除油菜bnafhy3基因在减小油菜花瓣面积中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为同时敲除bnafhy3基因在油菜a01、c01、a05和c05染色体上的4个同源拷贝，所述4个同源拷贝分别为基因

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因编辑crispr/cas9技术敲除油菜bnafhy3基因。

4.用于敲除油菜bnafhy3基因的载体在减小油菜花瓣面积中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体利用基因编辑crispr/cas9技术敲除油菜bnafhy3基因。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，bnafhy3基因的sgrna序列如seq id no.9所示：ggaaggaggaagactttgcg。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体将所述bnafhy3基因的sgrna序列克隆并构建到patu6-26-m载体，从而得到patu6-26-fhy3；之后利用kpn i和sal i酶将patu6-26-fhy3中的中的sgrna表达序列结构克隆到pubq10:cas9-p2a-gfp(hyg)载体中。

技术总结
本发明关于调控油菜花瓣大小的方法属于基因工程领域，提供敲除油菜Far‑Red Elongated Hypocotyl 3在调控油菜花瓣大小中的应用。在油菜中，BnaFHY3共有四个同源拷贝，分别位于A01、C01、A05和C05染色体上，分别为基因BnaA01G0219400WE/BnaA01.FHY3、BnaA05G0289800WE/BnaA05.FHY3、BnaC01G0308000WE/BnaC01.FHY3和BnaC05G0342900WE/BnaC05.FHY3。该应用利用基因编辑技术敲除油菜中A01、C01、A05和C05的BnaFHY3基因位点上的四拷贝，从而获得了bnafhy3纯合突变体。该突变体在开花时花瓣较正常野生型变小。在油菜中，花瓣面积与个体节能减耗、群体光能利用以及生态抑病等相关，小花瓣性状在这些方面具有优势。通过本发明可以快速获得小花瓣纯合突变体，为分子育种提供参考。

技术研发人员：王瑞森,李亚菲,徐世奇,涂梦欣,沈盟,权新华,袁晔,马燕欣,姚祥坦
受保护的技术使用者：嘉兴市农业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15