一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用

本发明属于海水鱼类细胞培养，具体涉及一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、石斑鱼（ epinephelussp.）属于硬骨鱼纲（osteichthyes）、鲈形目（perciformes）、鳍科（serranidae）、石斑鱼亚科（epinephelinate），是暖水性底栖鱼类，是我国南方和东南亚国家主要的经济养殖海水鱼类。赤点石斑鱼（ epinephelus akaara）是近些年在我国广东、福建等南方沿海地区引进的石斑鱼养殖品种，具有肉味鲜美、营养价值高、生长速度快、适应性强等优点。然而，随着石斑鱼养殖规模的扩大及养殖环境恶化，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的病害问题逐渐成为制约石斑鱼养殖业可持续发展的主要瓶颈。虹彩病毒和神经坏死症病毒是石斑鱼最主要的两种病毒性病原，研究病毒感染致病机理、病毒与宿主细胞相互作用将为阐明病原特性提供重要的理论信息，而研制高效的疫苗也能为预防和解决石斑鱼病毒性疾病提供有效防控策略。

2、鱼类细胞作为鱼体组织的细胞模型，不仅广泛应用于病毒的分离鉴定、病毒感染致病机制及宿主基因功能研究，也为研制病毒灭活疫苗以及环境污染物检测提供了细胞基础。鱼类细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、操作简单、重复性好，条件可控等诸多优点，逐渐应用于鱼类病毒病原学、免疫学、毒理学、代谢组学及疫苗学研究领域。至今，尽管已经建立200多种用于病毒分离鉴定和病毒学研究的鱼类细胞系，但来源于淡水鱼类的细胞系对海水鱼类病毒多不敏感。故迫切需要建立对不同病毒敏感的海水鱼类细胞系用于海水鱼类病毒病研究和防控。目前，尽管已经建立多种石斑鱼的组织细胞系，如石斑鱼脾脏细胞系、肾脏细胞系、脑细胞系等，但仍未见石斑鱼仔鱼细胞系的报道。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系（ epinephelus coioides fry cell line）ecfry，其保藏号为：gdmcc no：62561。

2、本发明的第二个目的是提供一种上述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系的构建方法，其包括以下步骤：

3、（1）原代培养：将斜带石斑鱼仔鱼无菌下漂洗后切碎，再次漂洗后进行组织贴块，加入原代细胞培养液培养获得原代细胞；

4、（2）传代培养：用胰酶消化原代细胞至变圆，分散细胞，加入传代细胞培养液和原代细胞培养液或加入传代细胞培养液进行传代培养，收集传代细胞，获得斜带石斑鱼细胞系。

5、优选地，所述的原代细胞培养液含石斑鱼血清。

6、优选地，所述的原代细胞培养液为：基础培养基l-15含体积比30%的胎牛血清、体积比0.5%的石斑鱼血清、质量比0.266%的nacl、5 mm的hepes、400 iu/ml青霉素、400 μg/ml链霉素和400 μg/ml制霉菌素，ph值为7.4；所述的传代细胞培养液为：基础培养基l-15含体积比10-20%的胎牛血清、质量比0.266%的nacl、5 mm的hepes、100 iu/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，ph值为7.4；所述的漂洗为用漂洗液培养基漂洗，漂洗液培养基为：基础培养基l-15加入400 iu/ml青霉素、400 μg/ml链霉素和400 μg/ml制霉菌素，ph值为7.4。

7、优选地，所述的斜带石斑鱼仔鱼选自孵化4天的养殖斜带石斑鱼，所述的组织贴块为将斜带石斑鱼仔鱼碎片贴入胎牛血清涂布后的培养瓶底部，所述的原代细胞为原代培养至形成细胞单层占培养瓶底部面积80%以上时的细胞，所述的传代细胞培养液和原代细胞培养液为体积比1:1的传代细胞培养液和原代细胞培养液。

8、本发明的第三个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在表达外源基因中的应用。

9、本发明的第四个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在水产动物病毒分离中的应用。

10、优选地，所述的病毒为sgiv或rgnnv。

11、本发明的第五个目的是提供上述斜带石斑鱼仔鱼细胞系在环境污染物监测中的应用。

12、优选地，所述的环境污染物为微塑料。

13、本发明的优点：

14、1. 本发明获得了斜带石斑鱼仔鱼细胞系ecfry，其生长状态良好，细胞增殖稳定，现已经稳定传代超90代，细胞形态以成纤维样为主要形态，并可超低温冻存，为斜带石斑鱼基因种质资源保存的相关研究奠定基础。

15、2. 本发明提供的斜带石斑鱼仔鱼细胞系的构建方法，采用组织贴块的方法进行原代细胞培养，在原代培养过程中添加适量的石斑鱼血清作为外源营养和生长因子。而传代过程中不需要添加其它生长因子，培养条件不严苛。

16、3. 本发明提供的斜带石斑鱼仔鱼细胞系对石斑鱼的两种重要病毒性病原敏感，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要细胞平台。

17、4. 本发明的斜带石斑鱼仔鱼细胞系可以直接应用于病毒感染致病机理、病毒-宿主细胞相互作用及外源基因功能研究。

18、5. 本发明的斜带石斑鱼仔鱼细胞系可以应用于环境中微塑料污染物的监测。

19、斜带石斑鱼仔鱼细胞系（ epinephelus coioides fry cell line）ecfry于2022年6月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：gdmcc no：62561。

技术特征：

1.一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系（epinephelus coioides fry cell line）ecfry，其特征在于，保藏号为：gdmcc no：62561。

2.一种权利要求1所述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的原代细胞培养液含石斑鱼血清。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的原代细胞培养液为：基础培养基l-15含体积比30%的胎牛血清、体积比0.5%的石斑鱼血清、质量比0.266%的nacl、5 mm的hepes、400 iu/ml青霉素、400 μg/ml链霉素和400 μg/ml制霉菌素，ph值为7.4；所述的传代细胞培养液为：基础培养基l-15含体积比10-20%的胎牛血清、质量比0.266%的nacl、5 mm的hepes、100 iu/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，ph值为7.4；所述的漂洗为用漂洗液培养基漂洗，漂洗液培养基为：基础培养基l-15加入400 iu/ml青霉素、400 μg/ml链霉素和400 μg/ml制霉菌素，ph值为7.4。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的斜带石斑鱼仔鱼选自孵化4天的养殖斜带石斑鱼，所述的组织贴块为将斜带石斑鱼仔鱼碎片贴入胎牛血清涂布后的培养瓶底部，所述的原代细胞为原代培养至形成细胞单层占培养瓶底部面积80%以上时的细胞，所述的传代细胞培养液和原代细胞培养液为体积比1:1的传代细胞培养液和原代细胞培养液。

6.权利要求1所述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系在表达外源基因中的应用。

7.权利要求1所述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系在水产动物病毒分离中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的病毒为sgiv或rgnnv。

9.权利要求1所述的斜带石斑鱼仔鱼细胞系在环境污染物监测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的环境污染物为微塑料。

技术总结
本发明公开了一株斜带石斑鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用。斜带石斑鱼仔鱼细胞系（ECFry）通过原代培养和传代培养构建得到，于2022年6月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为：GDMCC No：62561。ECFry细胞系可应用于石斑鱼病毒分离和环境污染物监测，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要细胞平台，也为后期石斑鱼病毒的分离、感染致病机理研究及细胞系作为体外毒理学细胞模型应用于监测环境污染物奠定了基础。

技术研发人员：黄晓红,郑家颖,黄友华,秦启伟,刘梦珂
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15