ATG16L1或其WD40结构域敲除细胞系作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种atg16l1或其wd40结构域敲除细胞系作为小rna病毒科病毒生产细胞系的应用。

背景技术：

1、小核糖核酸(rna)病毒科是由rna病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属，包括塞内卡病毒(seneca virus a，sva)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)、肠道病毒ev71等。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止小rna病毒科病毒的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。开发出有效的疫苗是当前该病防控最有效的举措。而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备有效疫苗的前提，急需开展相关工作。

2、其中，基因编辑技术是通过分子生物学方法对各类细胞中基因进行定向、精准的突变、修饰或编辑的技术。该技术已被广泛用于疾病治疗、抗病育种、遗传工程改造等研究领域。基因编辑技术不断发展成熟，从第一代的依赖锌指核酸酶zfn的编辑技术，第二代依赖转录激活样效应因子核酸酶talen的编辑技术，到第三代依赖成簇的规律性间隔的短回文重复序列crispr-cas9的编辑技术，历经发展近30年，已经取得了突破性的进展。第三代基因编辑技术crispr-cas9是利用小分子sgrna进行靶基因编辑的一种定向基因组编辑技术。该技术较前两代编辑技术更加便捷、高效、精准、稳定，而且相关使用成本费用更加低廉。为基因组定向改造、修饰、调控和应用等带来了突破性革命，在医学与生命科学各大领域具有广阔的应用前景。

3、自噬包含经典自噬和非经典自噬，而lc3相关的吞噬作用(lap)则属于非经典自噬。重要的是atg16l1的wd40 ctd缺失使非典型自噬丧失的同时不影响经典自噬，也就是说，wd40 ctd的缺失区分了经典巨噬和非经典自噬。文献报道lap可有助于vpu解除bst2限制，有利于hiv-1在表达bst2的细胞中释放，促进hiv-1的复制。但在其他文献中，lap又可限制甲型流感病毒的复制。本发明意外发现，抑制宿主细胞中atg16l1基因wd40结构域的表达使lap现象消失后，促进了小rna病毒科病毒的复制，尤其是fmdv、sva、ev71的复制；其次，本发明提供了特异性靶向atg16l1基因wd40结构域的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向wd40基因，结合crispr-cas9技术，在细胞系中实现了wd40结构域的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小rna病毒科病毒的复制，尤其是fmdv、sva、ev71的复制，提高小rna病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小rna病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明首先发现，抑制宿主细胞中atg16l1基因wd40结构域的表达能促小rna病毒科病毒的复制；其次，本发明提供了特异性靶向atg16l1基因wd40结构域的sgrna，所述的sgrna能够特异性靶向wd40结构域，结合crispr-cas9技术，在细胞系中实现了wd40结构域的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小rna病毒科病毒的复制，提高小rna病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小rna病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了atg16l1基因或其wd40结构域敲除细胞系作为小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。

3、优选地，所述小rna病毒科病毒包括fmdv、ev71、sva。

4、优选地，所述细胞系选自pk-15细胞系、vero细胞系。

5、第二方面，本发明提供了一种抑制或者沉默atg16l1基因或其wd40结构域表达的试剂在制备小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产增效剂中的应用。

6、优选地，所述小rna病毒科病毒包括fmdv、ev71、sva。

7、优选地，所述试剂包括靶向敲除atg16l1基因wd40结构域的sgrna，或靶向敲除atg16l1基因wd40结构域的sgrna与cas9蛋白的mrna组合。

8、优选地，所述sgrna选自sgrna1或sgrna2，所述sgrna1的靶向序列为：tgcagatgacacctccgatc；所述sgrna2的靶向序列为：ctgatcacacagaagagacc。

9、优选地，所述sgrna1由sgrna1-f和sgrna1-r退火形成的双链片段：

10、sgrna1-f：5’-tctgacctggagaccgagtg-3’：

11、sgrna1-r：5’-cggtcactggcaccctcact-3’。

12、优选地，所述sgrna2由sgrna2-f和sgrna2-r退火形成的双链片段：

13、sgrna2-f：5’-gcagctcttcctttttctcc-3’：

14、sgrna2-r：5’-gcattctttgtcaggtccac-3’。

15、本发明的有益效果是：①本发明首先发现，抑制宿主细胞中atg16l1基因wd40结构域的表达能促进小rna病毒科病毒fmdv、sva、ev71的复制；②本发明提供了靶向atg16l1基因wd40结构域的sgrna，所述sgrna能够特异性靶向wd40结构域，结合crispr-cas9技术可实现宿主细胞中wd40结构域的敲除，打靶准确、敲除效率高；③本发明提供了一种通过crispr-cas9技术将所述sgrna转染于宿主细胞，构建atg16l1基因或其wd40结构域敲除细胞系的方法；④依据本发明所述方法获得的单克隆细胞系能够显著促进小rna病毒科病毒fmdv、sva、ev71的复制，提高小rna病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒或病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.atg16l1基因或其wd40结构域敲除细胞系作为小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小rna病毒科病毒包括fmdv、ev71、sva。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞系选自pk-15细胞系、vero细胞系。

4.抑制或者沉默atg16l1基因或其wd40结构域表达的试剂在制备小rna病毒科病毒或病毒疫苗生产增效剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小rna病毒科病毒包括fmdv、ev71、sva。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制或者沉默atg16l1基因或其wd40结构域表达的试剂为靶向atg16l1基因wd40结构域的sgrna。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述sgrna选自sgrna1或sgrna2，所述sgrna1的靶向序列为：tgcagatgacacctccgatc；所述sgrna2的靶向序列为：ctgatcacacagaagagacc。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述sgrna1由sgrna1-f和sgrna1-r退火形成的双链片段：

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述sgrna2由sgrna2-f和sgrna2-r退火形成的双链片段：

技术总结
本发明属于基因工程领域，具体涉及ATG16L1或其WD40结构域敲除细胞系作为小RNA病毒科病毒生产细胞系的应用。本发明首先发现，抑制宿主细胞中ATG16L1或其WD40结构域的表达能促进小RNA病毒科病毒的复制；其次，本发明提供了特异性靶向ATG16L1基因WD40结构域的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向WD40基因，结合CRISPR‑Cas9技术，在细胞系中实现了WD40结构域的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小RNA病毒科病毒的复制，提高小RNA病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：郑海学,吴秀萍,杨洋,茹毅,郝荣增,任蕊芳,赵东梅,卢炳州,李亚军,刘华南,赵陇和
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25