一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用

本发明涉及青钱柳根系真菌，具体为一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用。

背景技术：

1、青钱柳是我国特有的珍稀木本药用植物，主要以收获叶片为主，具有降“三高”、抗衰老、恢复胰岛功能等生理功能，其叶中主要的活性物质是黄酮类和三萜类，然而现有的青钱柳根系内生真菌分离方法还存在一定程度的缺陷，比如说：

2、如发明公开号为cn103436451b的一株产红色素青钱柳内生菌及其发酵产红色素方法，刺盘孢属chss-1，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2013年6月2日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no.m2013241。此发明从植物青钱柳叶中分离筛选出产红色素的内生真菌chss-1，这为天然色素的提取和应用提供了一种微生物菌株；利用马铃薯和葡萄糖等原料为发酵基质进行发酵，产生的天然紫红色素，具有色泽自然鲜亮、稳定性强的特点，满足了市场的需求；

3、上述的一株产红色素青钱柳内生菌及其发酵产红色素方法利用马铃薯等原料进行发酵，使得其具有色泽自然鲜亮、稳定性强，但是青钱柳的人工栽培中，施肥等管理措施虽然促进了生长，但会强烈抑制叶中次生代谢物的合成和积累，造成青钱柳药用价值的下降。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的施肥等管理措施虽然促进了生长，但会强烈抑制叶中次生代谢物的合成和积累，造成青钱柳药用价值的下降问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，包括s1、挖取青钱柳细根；s2、预处理根系；s3、培养皿和培养箱；s4、观察鉴定；s5、dse的保存；s6、dse扩繁；s7、接种；

3、具体包含以下步骤：

4、s1：挖取青钱柳细根

5、挖取浅层的细根，用清水对细根进行清洗干净后，置于自封袋中，放入干冰带回实验室；

6、s2：预处理根系

7、将根系上的土壤等杂物进行再次冲洗干净，用剪刀剪成约2-3 cm长的根段，并用纱布包好后再次进行冲洗，转入超净工作台，通过无菌水和无菌剪刀将其根须剪段放入培养皿中；

8、s3：培养皿和培养箱

9、用镊子将表面消毒好的根段放入培养皿中，且将该培养皿放置在恒温培养箱内，25 ℃避光培养，等根段剪口处长出真菌后转入pda培养基进行纯化培养，直至获得单一菌株；

10、s4：观察鉴定

11、对分离出的内生真菌进行形态鉴定和分子鉴定，分子鉴定委托北京六合华大基因科技有限公司进行鉴定；

12、s5：dse的保存

13、配置保存液，配置好后置于冻存管中，在高压灭菌锅灭菌后放于干燥箱中，在超净工作台上将菌株放进冻存管中，最后将冻存管放于超低温冰箱中待以后使用；

14、s6：dse扩繁

15、取出储存的菌种，在超净工作台中将各内生真菌菌丝接种至pda培养基上，待培养基上长满菌丝，制作菌饼用于后续接种；

16、s7：接种

17、直接将长满菌丝的培养基作为接种剂接入青钱柳植株的根部。

18、进一步的，所述在万佛山青钱柳天然林中选取60年以上的呈聚群状分布且生长势良好的青钱柳大树，挖取浅层（0-30cm）细根（根横切面直径为0.5-1.0mm），置于自封袋中放入干冰中带回实验室4℃保存，此步骤选择合适的青钱柳细根，便于后续的使用。

19、进一步的，所述用剪刀剪成2-3cm根段，用自来水冲洗干净根部表面土壤后用纱布包好冲洗1h，用无菌水洗3-5次，每次3min，再用75%的乙醇浸泡半分钟后无菌水清洗3-5次，每次3min，用稀释50倍的84消毒液消毒15min，无菌水冲洗5次，每次3min，无菌剪刀将须根剪成0.3-0.5cm长的小段，用镊子放入培养皿中，每一个培养皿中放置5个根段，此步骤通过预处理将细根进行培养前的处理。

20、进一步的，所述将该培养皿放置在恒温培养箱中，25℃避光培养，待根段剪口处长出真菌后用接种针挑取菌丝在pda培养基上进行纯化培养，直至获得单一菌株（菌落），此步骤将根段处通过培养皿和培养箱进行培养。

21、进一步的，所述将菌株接入新的pda培养基上，置于25℃避光培养，每个菌株五个重复，待菌落长满培养皿时测量菌落直径，观察描述菌株培养特征，此步骤将菌株放置在培养基上进行培养。

22、进一步的，所述将甘油（v）：纯水（v）=2:8配置好后置于冻存管中，将纯化后的菌株连同培养基在超净工作台上分为小块，每个冻存管放3块，每种菌放5个冻存管，此步骤将通过冻存管对菌进行存放。

23、进一步的，所述在超净工作台上将各内生真菌菌丝用接种针挑取至pda培养基上，此步骤通过接种针将真菌菌丝进行取出。

24、进一步的，所述直接将长满菌丝的培养基作为接种剂接入青钱柳植株的根部（使苗根与内生真菌菌丝充分接触），最后用土覆盖用手轻轻压实，此步骤能够使得苗根与内生真菌菌丝充分接触。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、1.该青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，可协同提高青钱柳的生长和次生代谢，克服了传统栽培中要提高次生代谢含量必须限制生长的弊端；

27、2.该青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，与施肥和喷施化学药剂相比，采用内生真菌接种来提高植物次生代谢对环境安全无污染；

28、3.该青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，能够快速的进行培育，避免重新使用菌丝时需要等待较长时间的问题，分离到的菌株可长期使用和大规模扩繁。

技术特征：

1.一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，包括s1、挖取青钱柳细根；s2、预处理根系；s3、培养皿和培养箱；s4、观察鉴定；s5、dse的保存；s6、dse扩繁；s7、接种；

2.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述在万佛山青钱柳天然林中选取60年以上的呈聚群状分布且生长势良好的青钱柳大树，挖取浅层（0-30 cm）细根（根横切面直径为0.5-1.0 mm），置于自封袋中放入干冰盒中带回实验室，在4℃条件下保存。

3.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述用剪刀剪成2-3 cm长的根段，用自来水冲洗干净根部表面土壤后用纱布包好冲洗1 h，用无菌水洗3-5次，每次3 min，再用75%的乙醇浸泡半分钟后，用无菌水冲洗3-5次，每次3min，用稀释50倍的84消毒液消毒15 min，无菌水冲洗5次，每次3 min，无菌剪刀将细根剪成0.3-0.5 cm长的小段，用镊子放入培养皿中，每一个培养皿中放置5个根段。

4.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述将该培养皿放置在恒温培养箱中，25 ℃避光培养，待根段剪口处长出真菌后用接种针挑取菌丝在pda培养基上进行纯化培养，直至获得单一菌株（菌落）。

5.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述将菌株接入新的pda培养基上，置于25 ℃避光培养，每个菌株五个重复，待菌落长满培养皿时测量菌落直径，观察描述菌株培养特征。

6.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述将甘油（v）：纯水（v）=2:8配置好后置于冻存管中，将纯化后的菌株连同培养基在超净工作台上分为小块，每个冻存管放3块，每种菌放5个冻存管。

7.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述在超净工作台上将各内生真菌菌丝用接种针挑取至pda培养基上。

8.根据权利要求1所述的一种青钱柳根系内生真菌分离方法及其应用，其特征在于：所述直接将长满菌丝的培养基作为接种剂接入青钱柳植株的根部（使苗根与内生真菌菌丝充分接触），最后用土覆盖用手轻轻压实。

技术总结
本发明公开了一种青钱柳根系内生真菌（DSE）分离的方法及其应用，包括S1、挖取青钱柳细根；S2、预处理根系；S3、培养皿和培养箱；S4、观察鉴定；S5、DSE的保存；S6、DSE扩繁；S7、接种；挖取生长健壮的青钱柳大树浅层细根，用清水对细根进行清洗干净后，置于自封袋中，放入干冰盒带回实验室。该方法可协同提高青钱柳的生长和次生代谢，克服了传统栽培中要提高次生代谢含量必须限制生长的弊端；与施肥和喷施化学药剂相比，采用内生真菌接种来提高植物次生代谢对环境安全无污染；能够快速的进行培育，避免重新使用菌丝时需要等待较长时间的问题，分离到的菌株可长期使用和大规模扩繁。

技术研发人员：邓波,赵婷婷,刘正阳,于邦友,邓逸敏
受保护的技术使用者：安徽农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15