一种微小杆菌凝乳酶及其应用

本发明属于微生物酶，具体涉及一种微小杆菌凝乳酶及其在水解牛奶酪蛋白产生抗氧化肽中的应用。

背景技术：

1、凝乳酶(chymosin,milk-clotting enzymes,mces,ec 3.4.23.4)是食品工业，尤其是乳制品加工行业中的常用酶制剂。在奶酪制作过程中，凝乳酶可以水解κ-酪蛋白中的特定肽键(phe105-met106)而将乳液中的酪蛋白从溶解状态转变为凝胶状态，从而形成奶酪的基本结构，有助于形成奶酪的特定口感和质地。此外，凝乳酶也被用于健康产品中，如营养补充剂和消化酶产品，用于改善消化和吸收。

2、凝乳酶最初主要来源于新生的哺乳动物，尤其是牛犊的胃液，牛犊胃中产生的酶可以帮助他们消化乳蛋白，这些酶被提取出来用于制作凝乳酶。然而，牛犊胃来源的凝乳酶产量低，仅满足世界乳凝剂需求量的20-30％；此外，出于不愿消费用动物源凝乳酶的奶酪消费者，促使市场越来越倾向于凝乳酶供应的多样化。现阶段，商业化的凝乳酶通常通过微生物发酵生产，利用一些特殊的微生物(如某些细菌或酵母)发酵或经遗传工程改造的微生物能够发酵生产凝乳酶。这种方法比从动物胃液中提取的凝乳酶产量更大、成本更低、酶作业的适应性更强，可以更有效地大规模生产凝乳酶。目前，由rhizomucor miehei和rhizomucor pusillus丝状真菌产生的凝乳酶是目前应用最广泛的商业酶制剂。

3、凝乳酶的凝乳活性(milk-clotting activity,mca)与其蛋白水解活性(proteaseactivity,pa)比值是评价凝乳酶适用性的关键。当凝乳酶的pa高时酶对蛋白底物的过度水解会产生苦味肽，影响奶酪口感。因此理想的凝乳酶应具有较高的mca/pa比值，该比值是评价凝乳酶适用性的关键指标之一。

4、牛奶酪蛋白被凝乳酶、天然牛奶蛋白酶和乳酸菌的内肽酶水解会产生功能肽，是胃肠道、激素、免疫、神经和营养反应的潜在生理调节剂。目前已从不同乳源制品中筛选出多种活性肽，如具有阿片肽活性的α-酪啡肽、β-酪啡肽、γ-酪啡肽(nutr.rev.2012,70(4):241-255)，具有降血压活性的血管紧张素转换酶抑制肽(int.dairy j.2007,17(5):481-487)等。芬兰维利奥(valio)有限公司乳制品evolus通过在牛奶中加入特定的乳酸菌发酵，产生降血压肽ipp和vpp达到降低血压的目的。近年来中国乳业发展迅速，但国内乳源活性肽行业依然存在许多空白。现阶段我国的乳制品活性肽还是主要依赖进口，产业化生产不足，高品质的功能性乳制品基本上被国外企业垄断，亟需自主创新。

5、细菌源凝乳酶通常具有较低的mca/pa值及较高的pa值，导致奶酪产量降低，同时容易产生苦味肽，限制了其应用。然而与真菌相比，细菌具有更大的生物多样性和酶多样性，不同的细菌产生的凝乳酶会有不同的凝乳特点、不同的温度和ph敏感性、不同的酶切位点等酶学特征，会影响其在食品工业中的使用。为了扩大凝乳酶的应用，亟需寻找新型的凝乳酶产生菌和凝乳酶，研究凝乳酶的酶学性质，评估其应用潜力，丰富菌株资源库和酶资源库。

技术实现思路

1、针对目前研究现状和产业需求，本发明提供了一种微小杆菌p6产生的凝乳酶及其应用。

2、本发明所提供的一种微小杆菌凝乳酶，是通过微小杆菌p6发酵所产生的；所述的微小杆菌p6于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.24453，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：微小杆菌exiguobacterium sp。

3、上述的微小杆菌凝乳酶的制备方法如下：将微小杆菌p6种子液按2％体积比接种量接入培养基中，25℃，180r/min培养48h后，在4℃，11000r/min离心10min去菌体得到粗酶液，然后利用质量分数为40～70％的硫酸铵梯度沉淀和sp sepharose fast-flow离子交换层析对粗酶液进行纯化，所述的培养基的成分为：羽毛15g/l，nacl 0.5g/l，k2hpo4 1.0g/l，kh2po4 0.4g/l，mgcl2·7h2o 0.1g/l，cacl2 0.06g/l。

4、并且，所述的微小杆菌凝乳酶的使用方法如下：将微小杆菌凝乳酶加入8～12％(w/v)脱脂奶中，脱脂奶含0.01±0.002mol/l cacl2，酶与底物体积比1:10～1:100，在34～36℃凝乳5～40min。

5、微小杆菌凝乳酶在牛乳凝结中的应用，同样落入本发明所保护的技术范围中，所述的凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽。

6、本发明的有益效果在于：

7、(1)微小杆菌凝乳酶具有较高的凝乳活力，所述的凝乳酶在15min即能使5ml脱脂奶粉完全凝固，计算得凝乳酶凝乳活力为330.2±7.23su/ml。目前未见微小杆菌属细菌产生凝乳酶的报道及应用。

8、(2)理想的凝乳酶应具有较高的mca/pa比值，该比值是评价凝乳酶适用性的关键指标之一。本发明提供的微小杆菌凝乳酶具有较高的mca/pa值(21.43)和较低的pa值(15.41u/ml)，能保证奶酪产量的同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽，因此本发明凝乳酶具有很好的适用性和潜在应用价值。

9、(3)微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白会产生抗氧化肽，当水解物浓度为200μg/ml时，dpph自由基清除活性为75.32％，同样浓度的维生素c的dpph自由基清除活性为90％。本发明为乳源活性肽的酶法制备提供了新途径。

技术特征：

1.一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶是通过微小杆菌p6发酵所产生的；所述的微小杆菌p6于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.24453，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为：微小杆菌exiguobacterium sp。

2.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的制备方法如下：将微小杆菌p6种子液按2%体积比接种量接入培养基中，25ºc，180 r/min培养48 h后，在4ºc，11000 r/min离心10 min去菌体得到粗酶液，然后利用质量分数为40~70%的硫酸铵梯度沉淀和sp sepharose fast-flow离子交换层析对粗酶液进行纯化，所述的培养基的成分为：羽毛15 g/l，nacl 0.5 g/l，k2hpo4 1.0 g/l，kh2po4 0.4 g/l，mgcl2·7h2o0.1 g/l，cacl2 0.06 g/l。

3.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的凝乳活力为330.2 ± 7.23 su/ml。

4.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，所述的微小杆菌凝乳酶的使用方法如下：将微小杆菌凝乳酶加入8~12%（w/v）脱脂奶中，脱脂奶含0.01 ± 0.002mol/lcacl2，酶与底物体积比1:10~1:100，在34~36℃凝乳5~40min。

5.如权利要求1所述的一种微小杆菌凝乳酶，其特征在于，凝乳酶的蛋白酶活力为15.41 ± 0.5 u/ml，凝乳活力与蛋白酶活力的比值为21.43，能保证奶酪产量，同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽。

6.微小杆菌凝乳酶在牛乳凝结中的应用，其特征在于，所述的凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽。

技术总结
本发明属于微生物酶技术领域，具体涉及一种微小杆菌凝乳酶及其应用。本发明所提供的微小杆菌P6发酵所产生的凝乳酶具有良好的凝乳活性，其凝乳活力MCA为330.2±7.23SU/mL；本发明提供的微小杆菌凝乳酶具有较高的MCA/PA值（21.43）和较低的PA值（15.41U/mL），能保证奶酪产量的同时不会造成底物的过度水解产生苦味肽，因此，本发明凝乳酶具有很好的适用性和潜在应用价值；此外，本发明提供的微小杆菌凝乳酶水解牛奶酪蛋白能产生抗氧化肽，当水解物浓度为200µg/mL时，DPPH自由基清除活性为75.32%，同样浓度的维生素C的DPPH自由基清除活性为90%，这为乳源活性肽的酶法制备提供了新途径。

技术研发人员：边斐,岳寿松,朱友峰,马德源
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11