一种高滴度BaEV假型慢病毒载体及其制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种高滴度baev假型慢病毒载体及其制备方法。

背景技术：

1、慢病毒载体是一种源于人类免疫缺陷病毒的基因载体，被广泛用于真核细胞如造血干细胞和神经细胞的基因编辑。随着对基因递送工具长期深入的研究，慢病毒作为基因载体已然广泛用于基础研究和临床实践当中。随着后基因组时代的来临，基因治疗在医学研究中所占比重越来越大。一些难以根治或者缓解的传统疾病可以通过基因治疗缓解甚至治愈，慢病毒为未来基因治疗的发展提供了新的工具和方法。其中水疱性口炎病毒g蛋白(vsv-g)假型慢病毒已被广泛应用于基因治疗。但该假型慢病毒转导造血干细胞及部分淋巴细胞时，转导效率相对较低。

2、申请号为201280053749.1的专利申请公开了一种生产用突变体狒狒内源性逆转录病毒(baev)糖蛋白假型化的慢病毒载体的方法，具体为：在转染前24小时，将2.6×106个hek293t细胞接种至10-cm2组织培养皿上。使293t细胞在补充有10％胎牛血清(fcs，gibco)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem，invitrogen)中生长。使用8.6μg gag-pol包装构建体8.91和编码gfp的hiv-1衍生的sin转移载体phiv-sffv-gfp-sin和2.5μg编码vsv-g糖蛋白(gp)的pmd.g或7μgphcmv-rd114/tr、phcmv-baevwt、phcmv-baev/tr或phcmv-baevrless通过磷酸钙沉淀转染细胞。在转染后16小时，用无血清培养基(opti-mem，invitrogen)替代dmem培养基，并在转染后36小时，收获载体，过滤通过0.45μm孔径的膜，并使用超滤浓缩系统(vivaspin，satorius；3000g，2小时(4℃))，或通过将病毒上清液在4℃下以3000g离心过夜而低速浓缩或者通过超速离心(4℃，25000rpm，2小时)而浓缩。随后，将载体储存于-80℃。该方法得到的baev糖蛋白假型化慢病毒载体虽然可以有效提高对造血干细胞及自然杀伤细胞的转染效率，用于制备治疗造血功能障碍或自身免疫性疾病的药物，但是该方法得到的baev糖蛋白假型化慢病毒载体的滴度较低，前期病毒生产成本较高。为了解决上述问题，亟需开发出一种制备高滴度baev假型慢病毒载体的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备高滴度baev假型慢病毒载体的方法，以及由该方法制备得到的baev假型慢病毒载体。

2、本发明提供了一种制备假型慢病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

3、(a)将包装细胞接种于培养容器中培养；

4、(b)将穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒加入细胞培养基中，混合得到a液；将转染试剂加入细胞培养基中，混合得到b液；

5、所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：(0.5-1.5)：(0.85-2.00)；

6、(c)待步骤(1)包装细胞汇合度为70％-90％时，将a液与b液混合并加入培养容器进行转染；

7、(d)转染结束后，收获假型慢病毒载体。

8、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：(0.97-1.34)；转染试剂与三种质粒总质量的比值为(2-4)：1；所述转染试剂为聚乙烯亚胺，lipofectaminetm2000或者lipofectaminetm3000。

9、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：0.98；转染试剂与三种质粒总质量的比值为3：1。

10、进一步地，步骤(b)中，所述包膜质粒含有编码baev糖蛋白或修饰的baev糖蛋白的序列，优选地，所述修饰的baev糖蛋白为baev-rless糖蛋白。

11、进一步地，步骤(b)中，所述穿梭质粒为pcdh-gfp，包装质粒为pspax2，包膜质粒为pcmv-baev-rless。

12、进一步地，步骤(a)中所述包装细胞为胚胎肾细胞；

13、步骤(b)中所述培养基为减血清培养基；转染前1小时，培养容器中的培养基为opti-mem培养基；转染6小时后，培养容器中的培养基为10％胎牛血清培养基。

14、进一步地，步骤(c)中，所述转染的时间为48小时以上。

15、进一步地，步骤(a)中，在将包装细胞接种于培养容器中培养之前，还包括以下步骤：用多聚-l-赖氨酸溶液包被培养容器。

16、进一步地，所述多聚-l-赖氨酸溶液的浓度为6-12μg/ml，优选为10μg/ml。

17、本发明还提供了上述方法制备得到的假型慢病毒载体。

18、本发明中，baev假型慢病毒载体指用突变体baev糖蛋白假型化的慢病毒载体，该载体的病毒包膜具有baev包膜的特有结构和表面标志物。

19、baev-rless糖蛋白是一种修饰的baev包膜糖蛋白，指胞质尾结构域缺乏融合抑制性r肽的baev包膜糖蛋白。

20、融合抑制性r肽指包膜糖蛋白的胞质尾结构域的c-末端部分，其携带酪氨酸内吞信号-yxxl，并在病毒颗粒成熟过程中被病毒蛋白酶裂解，从而增强包膜糖蛋白的膜融合。baev包膜糖蛋白的融合抑制性r肽通常位于野生型baev包膜糖蛋白的氨基酸547和564之间。

21、与现有技术相比，本发明制备baev假型慢病毒载体的方法取得了以下有益效果：

22、(1)本发明通过调整包装baev假型慢病毒的穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的比例，明显提高了病毒的包装效率，提高了病毒滴度。

23、(2)本发明通过在转染hek293t细胞之前使用多聚-l-赖氨酸包被培养皿，使hek293t细胞在培养皿底的贴壁更加紧密，减少了在生产病毒过程中因合胞体出现而导致的细胞脱落凋亡，达到了提高病毒滴度目的。

24、(3)本发明将使用多聚-l-赖氨酸包被培养皿与调整转染体系中质粒比例结合，进一步显著提高了慢病毒滴度，降低了baev假型慢病毒载体的生产成本。

25、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

26、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种制备假型慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：(0.97-1.34)；转染试剂与三种质粒总质量的比值为(2-4)：1；所述转染试剂为聚乙烯亚胺，lipofectaminetm2000或者lipofectaminetm3000。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的质量比为1：1：0.98；转染试剂与三种质粒总质量的比值为3：1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述包膜质粒含有编码baev糖蛋白或修饰的baev糖蛋白的序列，优选地，所述修饰的baev糖蛋白为baev-rless糖蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述穿梭质粒为pcdh-gfp，包装质粒为pspax2，包膜质粒为pcmv-baev-rless。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述包装细胞为胚胎肾细胞；

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述转染的时间为48小时以上。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，在将包装细胞接种于培养容器中培养之前，还包括以下步骤：用多聚-l-赖氨酸溶液包被培养容器。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多聚-l-赖氨酸溶液的浓度为6-12μg/ml，优选为10μg/ml。

10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的假型慢病毒载体。

技术总结
本发明提供了一种高滴度BaEV假型慢病毒载体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明通过调整包装BaEV假型慢病毒的穿梭质粒、包装质粒和包膜质粒的比例，明显提高了病毒的包装效率，提高了病毒滴度。本发明进一步在转染细胞之前使用多聚‑L‑赖氨酸包被培养皿，使细胞在培养皿底的贴壁更加紧密，减少了在生产病毒过程中因合胞体出现而导致的细胞脱落凋亡，提高了病毒滴度，降低了假型慢病毒载体的生产成本。

技术研发人员：曾金杰,余鼎,梁洪,刘东,赵义林,吴佳君
受保护的技术使用者：成都蓉生药业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25