与mStayGold荧光蛋白相互作用的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程，涉及与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、staygold蛋白是在2022年被发现的一种来源于cytaeis uchidae水母中，具有极强荧光强度和稳定性的绿色荧光蛋白且还耐受photobleaching(光漂白)效应，因此在从单粒子成像到体积成像中都具有潜在的应用场景。天然状态下的staygold蛋白为二体状态，因此限制其作为荧光标签使用，随着其单体状态下的蛋白(mstaygold)陆续被报道，扩展了mstaygold作为荧光标签的应用场景，可以与目标蛋白融合表达，用于观察目标蛋白的亲和纯化、细胞定位及分子运动等方面。

2、纳米抗体(nanobody)是一类首次在骆驼中发现的单域抗体，这种重链抗体只由两条重链组成，不含轻链，它们重链的单个可变区足以识别并结合抗原，具备分子量具有小分子量、高亲和力和稳定性等优势。此外，由于其结构简单，容易折叠，因此可以在细菌和酵母中大量生产，以纳米抗体为基础的药物研发和生物学应用是近年来的热点领域。除此之外，纳米抗体也适用于蛋白表达和纯化领域，比如制备成检测和纯化蛋白的试剂和工具等。

3、mstaygold具有荧光强度强且稳定的特点，将会被广泛地应用于荧光蛋白标签领域，其纳米抗体的发现可以有助于staygold标签蛋白的纯化。目前针对mstaygold的纳米抗体还未报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供了四种针对mstaygold绿色荧光蛋白的纳米抗体及其在纯化方面的应用。

2、本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

3、本发明的第一目的在于提供与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体，所述mstaygold蛋白的氨基酸序列seq id no.9所示，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno.1-4所示，依次命名为s2g10、s4f1、s2d9和s4a10。

4、进一步改进在于，所述纳米抗体通过酵母表面展示的技术获取。

5、本发明的第二目的在于提供编码上述与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体的基因，编码所述纳米抗体的基因的核苷酸序列如seq id no.5-8所示。

6、本发明的第三目的在于提供一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述基因且能够翻译表达出上述纳米抗体的表达载体。

7、进一步改进在于，所述表达载体为pet-22b。

8、本发明的第四目的在于提供一种宿主细胞，为转入上述重组质粒的大肠杆菌bl21。

9、本发明的第五目的在于提供与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体的以下应用：

10、(1)在检测mstaygold标签蛋白相互作用；

11、(2)在mstaygold绿色荧光蛋白或mstaygold绿色荧光融合蛋白的富集、检测和纯化方面的应用。

12、本发明的第六目的在于提供一种mstaygold免疫亲和吸附材料，所述免疫亲和基质中含有上述与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体、strep-tactin填料和buffer。

13、本发明的第七目的在于提供一种上述mstaygold免疫亲和吸附材料的制备方法，制备步骤如下：

14、(1)用100mm ph 7.5的hepes、150mm nacl、5％glycerol缓冲液平衡strep-tactin填料；

15、(2)分别取50μl strep-tactin填料与1.5mg所述纳米抗体，4℃孵育1小时后，4000rpm离心2min后在所述填料中加入100mm ph 7.5的hepes、150mm nacl、5％glycerol清洗一次，4000rpm离心2min；

16、(3)再在填料中加20μl buffer，获得所述免疫亲和吸附材料。

17、本发明的第八目的在于提供一种上述mstaygold免疫亲和吸附材料在纯化mstaygold标签蛋白纯化中的应用。

18、本发明具有如下有益效果：

19、本发明提供了可以与mstaygold特异性结合的4种纳米抗体，该纳米抗体与mstaygold蛋白具有较高的亲和力，可以用于mstaygold蛋白以及mstaygold融合蛋白的检测和纯化。本发明提供的4种纳米抗体能够在大肠杆菌中高效表达，生产过程简单，成本低且产量高。因此具有广阔的应用市场。

技术特征：

1.与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体，其特征在于，所述mstaygold蛋白的氨基酸序列seq id no.9所示，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1-4所示。

2.根据权利要求1所述的与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体通过酵母表面展示的技术获取。

3.编码权利要求1-2任一所述与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体的基因，其特征在于：编码所述纳米抗体的基因的核苷酸序列如seq id no.5-8所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求3所述的基因且能够翻译表达出如权利要求1-2任一所述纳米抗体的表达载体。

5.根据权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pet-22b。

6.一种宿主细胞，其特征在于，为转入权利要求4-5任一所述重组质粒的大肠杆菌bl21。

7.权利要求1-2任一所述的与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体在检测mstaygold标签蛋白相互作用以及在mstaygold绿色荧光蛋白或mstaygold绿色荧光融合蛋白的富集、检测和纯化方面的应用。

8.一种mstaygold免疫亲和吸附材料，其特征在于，所述免疫亲和基质中含有权利要求1-2任一所述的与mstaygold荧光蛋白相互作用的纳米抗体、strep-tactin填料和buffer。

9.一种如权利要求8所述mstaygold免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

10.一种权利要求8所述mstaygold免疫亲和吸附材料在纯化mstaygold标签蛋白纯化中的应用。

技术总结
本发明公开了与mStayGold荧光蛋白相互作用的纳米抗体及其应用，涉及蛋白质工程技术领域，该纳米抗体有4种，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明提供的4种纳米抗体均可以在大肠杆菌中高效表达，生产过程简单，成本低且产量高。这四种纳米抗体均可以与mStayGold特异性结合，具有较高的亲和力，亲和力分别为51nM、22nM、217nM和1.8nM；本发明提供的4种针对mStayGold的纳米抗体还可以用于检测、富集纯化mStayGold或者mStayGold融合蛋白。

技术研发人员：王峰,石侯霞,杨益虎,桂文君,陈倩,高敏奇
受保护的技术使用者：无锡佰翱得生物科学股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/25