一种烟曲霉检测引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及真菌检测，尤其涉及一种烟曲霉检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、烟曲霉（ aspergillus fumigatus）是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，是曲霉属的一种，其能够产生大量的分生孢子扩散至空气中而广泛传播，通过呼吸道或创口进入体内导致感染，对人类健康造成巨大伤害。烟曲霉引发的疾病主要包括侵袭性曲霉疾病、慢性肺曲霉病、曲霉肿，以及过敏性疾病如哮喘和过敏性支气管肺曲霉病，其中最严重的是侵袭性曲霉菌病（invasive aspergillosis, ia）。而在曲霉所引起的系统性感染疾病中，约90%是由烟曲霉引起的。有研究显示，侵袭性真菌感染死亡患者的早期诊断率仅为12%~60%，未能准确诊断和积极治疗是侵袭性真菌感染致死率高的主要因素。因此，开发烟曲霉感染早期诊断方法，是真菌感染针对性治疗的前提，对降低真菌感染致死率具有重要意义。

2、根据《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》（2022版），目前对侵袭性真菌感染的临床检测可分为组织学检查和微生物学检查两类。其中组织学检查虽然可直接获得感染部位的病原菌，但在病原菌载量低时仍需培养步骤，耗时较长，不适于早期诊断。而微生物学检查中，直接镜检存在假阴性、敏感度不高等问题。真菌培养鉴定也存在阳性率低的问题，同时耗时较长。血清学检测中的g试验和gm试验广泛用于曲霉菌属感染的早期筛查和连续检测，但存在假阳性的情况。

3、目前基于分子生物学方法的烟曲霉检测特异性较差，且流程大都依赖于特定检测仪器，缺乏便捷性，例如中国专利cn108707691a和cn109811079a公开的使用荧光定量pcr技术检测烟曲霉的方法，但此类技术依赖于荧光检测仪器和专业人员的操作。中国专利cn113335731a公开了使用基于rpa配合crispr的检测技术，虽然获得了较高的检测灵敏度，但结果判读时仍需要荧光检测仪器的辅助，不利于检测的便捷化，并且上述技术方案均存在假阳性、导致检测不准确的风险。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种烟曲霉检测引物组、试剂盒及其应用，以解决现有技术中烟曲霉检测不准确的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种烟曲霉检测引物组，包括以下引物：

4、核苷酸序列如seq id no.1所示的引物af f3；

5、核苷酸序列如seq id no.2所示的引物af fip；

6、核苷酸序列如seq id no.3所示的引物af lf；

7、核苷酸序列如seq id no.4所示的引物af bip；

8、核苷酸序列如seq id no.5所示的引物af lb；

9、核苷酸序列如seq id no.6所示的引物af b3。

10、优选的，所述引物af fip的5’端标记有荧光基团；

11、所述引物af lb的5’端标记有生物素。

12、优选的，所述荧光基团为fam或fitc。

13、本发明还提供了上述烟曲霉检测引物组在制备检测烟曲霉的试剂盒中的应用。

14、本发明还提供了一种检测烟曲霉的试剂盒，包括检测试剂和上述烟曲霉检测引物组。

15、优选的，所述试剂盒中引物af fip的终浓度为1.6~2.4μmol/l；

16、所述试剂盒中引物af bip的终浓度为1.6~2.4μmol/l。

17、优选的，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶。

18、优选的，所述等温扩增缓冲液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20。

19、优选的，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条。

20、优选的，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫依次设置于底板上；所述判读区上依次设置检测线和质控线；

21、所述检测线中包被有fam抗体，所述fam抗体的浓度为0.05~0.15mg/ml；

22、所述质控线中包被有biotin-bsa溶液，所述biotin-bsa溶液的浓度为1.5~3mg/ml。

23、本发明的有益效果：

24、本发明提供的烟曲霉检测引物组灵敏度高、特异性强，检测限低至500 copies/ml，有助于烟曲霉感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情。

25、本发明提供的检测烟曲霉的试剂盒采用恒温扩增-核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；使用本发明提供的试剂盒单次检测费用低，对仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，能够进行居家自测试，有助于深部真菌感染的早诊。

技术特征：

1.一种烟曲霉检测引物组，其特征在于，包括以下引物：

2.根据权利要求1所述的烟曲霉检测引物组，其特征在于，所述引物af fip的5’端标记有荧光基团；

3.根据权利要求2所述的烟曲霉检测引物组，其特征在于，所述荧光基团为fam或fitc。

4.权利要求1~3任一项所述的烟曲霉检测引物组在制备检测烟曲霉的试剂盒中的应用。

5.一种检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，包括检测试剂和权利要求1~3任一项所述的烟曲霉检测引物组。

6.根据权利要求5所述的检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物af fip的终浓度为1.6~2.4μmol/l；

7.根据权利要求5所述的检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dntp和bst dna聚合酶。

8.根据权利要求7所述的检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液包括tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4和tween-20。

9.根据权利要求5所述的检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条。

10.根据权利要求9所述的检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫依次设置于底板上；所述判读区上依次设置检测线和质控线；

技术总结
本发明提供了一种烟曲霉检测引物组、试剂盒及其应用，属于真菌检测技术领域，本发明提供的烟曲霉检测引物组包括如SEQ ID NO.1~6所示的引物，克服了现有技术中烟曲霉检测不准确的问题。本发明提供的烟曲霉检测引物组灵敏度高、特异性强，检测限低至500 copies/mL，有助于烟曲霉感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情。本发明提供的检测烟曲霉的试剂盒采用恒温扩增‑核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；使用本发明提供的试剂盒单次检测费用低，对仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，能够进行居家自测试，有助于真菌感染的早诊。

技术研发人员：李翔,陈海琴,李婷婷,陈冬冬
受保护的技术使用者：江苏美克医学技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15