一种用于评估肝纤维化病因控制预后的基因标志物组合及其应用

本发明涉及生物检测鉴定领域。更具体地，涉及一种用于评估肝纤维化病因控制预后的基因标志物组合及其应用。

背景技术：

1、全球肝病每年导致约200万人死亡，占所有死亡人数的4％，死亡主要归因于慢性肝炎诱发的肝硬化并发症和肝细胞癌，而急性肝炎占死亡人数的比例较少。多种病因，诸如病毒(hbv或hcv)感染、嗜酒、代谢异常、自身免疫损伤等均可引起慢性肝炎，而肝纤维化是慢性反复损伤刺激导致的肝内细胞外基质沉积与降解失衡，进而出现细胞外基质过度累积的一种病理过程。如果不加以干预将会进展为肝硬化甚至失代偿肝硬化或肝细胞癌，严重危害了人类的生命健康。

2、当前治疗肝硬化的主要手段为消除病因，然而临床研究证据表明去除损伤刺激因素可有效逆转肝纤维化，但仍有部分患者难以逆转。比如，抗乙肝病毒治疗后，约50％的患者肝纤维化逆转，但仍有部分难以逆转，甚至进一步恶化(yameng sun,jialing zhou,linwang,xiaoning wu,yongpeng chen,hongxin piao,lungen lu,wei jiang,youqing xu,bofeng,yuemin nan,wen xie,guofeng chen,huanwei zheng,hai li,huiguo ding,huiliu,fudong lv,chen shao,tailing wang,xiaojuan ou,bingqiong wang,shuyan chen,aileen wee,neil d theise,hong you,jidong jia.new classification of liverbiopsy assessment for fibrosis in chronic hepatitis b patients before andafter treatment.hepatology.2017may；65(5):1438-1450.)；另外，在减重达10％以上的非酒精性脂肪性肝炎患者中，肝纤维化逆转率也仅有45％(eduardo vilar-gomez,yadinamartinez-perez,luis calzadilla-bertot,ana torres-gonzalez,bienvenido gra-oramas,licet gonzalez-fabian,scott l friedman,moises diago,manuel romero-gomez.weight loss through lifestyle modification significantly reducesfeatures of nonalcoholic steatohepatitis.gastroenterology.2015aug；149(2):367-378.)。近年来，人群的遗传异质性与肝纤维化发生的相关性越来越受到关注。研究表明多个基因诸如serpina1(karim hamesch,mattias mandorfer,vítor m pereira,linda smoeller,monica pons,grace e dolman,matthias c reichert,carolin v schneider,vivien woditsch,jessica voss,cecilia lindhauer,malin fromme,igor spivak,nurdan guldiken,biaohuan zhou,anita arslanow,benedikt schaefer,heinz zoller,elmar aigner,thomas reiberger,martin wetzel,britta siegmund,carolinarui gaspar,luís maia,dalila costa,mário bento-miranda,josef van helden,erayyagmur,danilo bzdok,jan stolk,wolfgang gleiber,verena knipel,wolframwindisch,ravi mahadeva,robert bals,rembert koczulla,miriam barrecheguren,marcmiravitlles,sabina janciauskiene,felix stickel,frank lammert,rodrigo liberal,joan genesca,william j griffiths,michael trauner,aleksander krag,christiantrautwein,pavel strnad；european alpha1-liver study group.liver fibrosis andmetabolic alterations in adults with alpha-1-antitrypsin deficiency caused bythe pi*zz mutation.gastroenterology.2019sep；157(3):705-719.e18.)，jak2(hatemrabie,warda othman,dalia m elsabaawy,eman e elshemy,neamat abdelmageed,fatmaa khalaf,hanan m bedair.janus kinase-2 mutation associated portal veinthrombosis complicating liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.asianpac j cancer prev.2021jan 1；22(1):267-275.)，afp(jing-wen wang,yong chen,qi-cai liu,guo-zhong liu,shu-yu zhang,yu-jia guo,dong-hong li,xing-ting chen,chen lin,feng gao.hnf-1binding point mutation of the afp gene promotescirrhosis in post-menopausal women.int j biol markers.2020mar；35(1):41-46.)，pnpla3(francesca virginia bruschi,thierry claudel,matteo tardelli,alessandracaligiuri,thomas m stulnig,fabio marra,michael trauner.the pnpla3 i148mvariant modulates the fibrogenic phenotype of human hepatic stellatecells.hepatology.2017jun；65(6):1875-1890.)等突变与肝纤维化发生显著相关。另外，前期研究发现loxl1g153d突变可显著影响慢乙肝纤维化抗病毒治疗后逆转率(专利号：cn116064765 b)。以上报道说明患者的遗传异质性不但影响了肝纤维化发生同时也影响了肝纤维化预后。近期研究通过对大量肝纤维化转录组谱的综合分析，发现了一个不受病因扰动的肝纤维化特异性细胞外基质基因集，基于该基因集甚至可将具有相同组织学纤维化分期的患者亚分类，亚分组患者具有不同的病理特征、肝脏硬度、肝内分子信号活性以及细胞景观，这可能是病因控制后不同肝纤维化患者临床获益不同的潜在原因(wei chen,yamengsun,shuyan chen,xiaodong ge,wen zhang,ning zhang,xiaoning wu,zhuolun song,huihan,romain desert,xuzhen yan,aiting yang,sukanta das,dipti athavale,natalianieto,hong you.matrisome gene-based subclassification of patients with liverfibrosis identifies clinical and molecular heterogeneities.hepatology.2023oct1；78(4):1118-1132.)。因此，除了遗传异质性外，肝内基因表达异质性也可能影响肝纤维化预后。目前国内外尚无关于肝内基因表达异质性影响肝纤维化预后的报道。

3、综上，肝纤维化的病因控制并不能逆转所有患者的纤维化状态。因此，在治疗肝纤维化患者时，应有效预测初治患者在长期病因控制预后肝纤维化的逆转情况，实现肝纤维化病因控制治疗后目标患者的优化，以此对病因控制预后不逆转的初治患者进行更好的临床诊治和监督管理。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供用于评估肝纤维化病因控制预后的基因标志物组合，以预测初治患者在长期病因控制预后肝纤维化的逆转情况，进而对病因控制预后不逆转的初治患者进行更好的临床诊治和监督管理。

2、本发明的另一个目的在于提供上述基因标志物组合的表达水平的检测试剂在制备评估肝纤维化病因控制预后的试剂盒中的应用。

3、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

4、本发明首先提供了一种用于评估肝纤维化病因控制预后的基因标志物组合，所述基因标志物组合包括18个与细胞周期相关的基因，即bub1b、cdc45、cdt1、chek1、clspn、depdc1、e2f8、ect2、kif11、kif18a、kif4a、kifc1、mki67、orc6、parpbp、pbk、rrm2和top2a。

5、本发明中所述bub1b的ensembl id为ensg00000156970、cdc45的ensembl id为ensg00000093009、cdt1的ensembl id为ensg00000167513、chek1的ensembl id为ensg00000149554、clspn的ensembl id为ensg00000092853、depdc1的ensembl id为ensg00000024526、e2f8的ensembl id为ensg00000129173、ect2的ensembl id为ensg00000114346、kif11的ensembl id为ensg00000138160、kif18a的ensembl id为ensg00000121621、kif4a的ensembl id为ensg00000090889、kifc1的ensembl id为ensg00000237649、mki67的ensembl id为ensg00000148773、orc6的ensembl id为ensg00000091651、parpbp的ensembl id为ensg00000185480、pbk的ensembl id为ensg00000168078、rrm2的ensembl id为ensg00000171848和top2a的ensembl id为ensg00000131747。

6、在本发明中，所述基因标志物组合还可以选自上述18个中的一种或几种。需要说明的是，虽然上述基因都是已知的基因，但是作为基因标志物组合却是本领域技术人员无法预期的。

7、本发明进一步提供了上述基因标志物组合的表达水平的检测试剂在制备评估肝纤维化病因控制预后的试剂盒中的应用。

8、进一步，所述评估肝纤维化病因控制预后是评估肝纤维化初治患者病因控制预后的逆转情况。

9、在本发明具体的实施方式中，所述逆转情况包括逆转和不逆转。

10、进一步，所述表达水平的检测试剂是指能够检测所述基因标志物组合各基因转录水平和蛋白水平的试剂。优选的，所述表达水平的检测试剂是利用包括转录组测序、捕获测序和qrt-pcr在内的任一种方法获得所述基因标志物组合的表达水平的试剂。在本发明具体的实施方式中，所述表达水平的检测试剂是利用转录组测序获得所述基因标志物组合的表达水平的试剂，在获得测序数据后，比对人类参考基因组(hg19)，并对表达丰度进行定量，获得基因标志物组合中各基因的表达水平。当然，本领域技术人员也可以利用其他任意方法获得所述基因标志物组合中各基因的表达水平。

11、本发明还提供了评估肝纤维化初治患者病因控制预后的逆转情况的方法，包括如下步骤：

12、1)、收集肝纤维化初治患者的肝穿石蜡组织；

13、2)、采用二代转录组测序获得肝纤维化初治患者的肝穿石蜡组织中基因标志物组合中各基因的表达水平；

14、3)、基于基因标志物组合中各基因的表达水平利用随机森林分类方法评估病因控制预后的肝纤维化初治患者的逆转情况。

15、进一步，所述步骤3)中基于基因标志物组合中各基因表达水平利用随机森林分类方法将病因控制预后的肝纤维化初治患者分为两类：基因标志物组合中各基因相对高表达组为病因控制预后逆转的初治患者，反之基因标志物组合中各基因相对低表达组为不逆转的初治患者。

16、本发明的有益效果如下：

17、本发明创新性地利用了肝纤维化初治患者的肝活检病理检测后剩余的肝组织石蜡块进行二代转录组测序，系统地比较了病因控制预后肝纤维化逆转患者与不逆转患者在初治时肝内差异表达的基因，鉴定出了一个包含18个与细胞周期相关的基因的基因标志物组合，其表达水平差异可用于预测初治患者在长期病因控制预后肝纤维化的逆转情况，进而对患者进行更好的临床诊治和监督管理，以期为更多的患者带来临床获益。