一种抗虫蛋白杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用

本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种抗虫蛋白cry 1ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用。

背景技术：

1、苏云金杆菌 (bacillus thuringiensis，bt) 是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药。该抗虫晶体蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：cry蛋白和cyt，其中cry蛋白对多种有害昆虫（如鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫）、线虫类和原生生物等的幼虫具有毒性。cry蛋白已经被转入农作物使其具有抗虫性，目前转cry 蛋白基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。cry 1ah 蛋白是 cry蛋白中的一种。

2、转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性；转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性；食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。因此，为了对转基因作物及其衍生物中 cry 1ah 蛋白进行快速分析，研究并得到抗 cry 1ah 蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗虫蛋白cry 1ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，其分泌的单抗为实现转基因作物中抗虫蛋白cry 1ah的检测奠定基础。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株3c4 2e6已于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.45483。

3、具体的，该杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

4、a) 纯化原核表达得到cry 1ah重组蛋白；

5、b) 免疫动物：将cry 1ah重组蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠；

6、c) 细胞融合：收集免疫balb/c小鼠的脾细胞并与sp2/0细胞进行融合；

7、d) 细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行elisa检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。

8、其中，小鼠的脾细胞与sp2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。

9、本发明还提供一种前述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行protein a-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。

10、具体的，杂交瘤细胞株3c4 2e6所产生的单克隆抗体通过间接 elisa检测所得到的效价为1:3072000，抗体的类型为igg1。

11、杂交瘤细胞株3c4 2e6所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中seq id no：1所示序列，可变区轻链氨基酸序列如序列表中seq id no：2所示序列。具体序列为：

12、 细胞株 重链可变区氨基酸序列 轻链可变区氨基酸序列 3c4 2e6 qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdynaafisrlsirkdisksqvffkinslrvndtaiyycatnhggydgayfsywgqgtlvtvsa dilltqspailsvspgervsfscrasqsigttihwyqqrtngsprllikyafesvsgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqsnnwpltfgagtklelkr

13、本发明还提供了上述单克隆抗体在cry 1ah抗虫蛋白定性检测中的应用。

14、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用原核表达纯化得到的重组抗虫蛋白cry 1ah作为抗原，通过杂交瘤技术制备了分泌抗cry 1ah的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株3c4 2e6，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接 elisa 效价为1:3072000，抗体亚型为igg1，所述单抗可以特异识别转基因玉米中cry 1ah蛋白，分泌抗cry1ah抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

15、保藏信息：

16、本发明提供的杂交瘤细胞株3c4 2e6，已于2023年2月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为cry1ah单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为cgmcc no.45483。

技术特征：

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45483。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，步骤c）中，小鼠的脾细胞与sp2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。

4.权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后对收集的腹水进行protein a-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，cgmcc no.45483所产生的单克隆抗体通过间接 elisa检测所得到的效价为1:3072000。

6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，cgmcc no.45483所产生的单克隆抗体的类型为igg1。

7.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，cgmcc no.45483所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中seq id no：1所示，可变区轻链氨基酸序列如序列表中seq id no：2所示。

8.根据权利要求4-7任一项所述的单克隆抗体在cry 1ah抗虫蛋白定性、定量检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种抗虫蛋白Cry 1Ah杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45483。其制备方法包括：a)纯化原核表达的Cry 1Ah重组蛋白；b)将Cry 1Ah重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；c)收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；d)通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5‑7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单抗为实现转基因作物中抗虫蛋白Cry 1Ah的检测奠定了基础。

技术研发人员：刘卫晓,金芜军,王睿哲,孟丽霞,董美,杨秀英,高进,王迪,赵伟玲,文婷婷
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15