一种磷酸化人体PD-L1蛋白特异性抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学，具体涉及磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体及其制备方法和应用，尤其涉及人pd-l1的t290位点磷酸化抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤的发生发展涉及多种遗传和表观遗传层面的改变，这些改变有助于产生肿瘤特异性抗原，导致机体免疫识别甚至免疫反应。为了逃避免疫系统的监视，肿瘤细胞在肿瘤微环境中通过各种机制上调程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1，pd-l1)的表达，pd-l1与t细胞表面的免疫检查点-程序性细胞死亡受体1(programmed celldeathprotein1，pd-1)结合，抑制t细胞功能导致t细胞耗竭现象。pd-1/pd-l1抑制剂可以阻断pd-1与pd-l1的结合，使t细胞恢复活性，从而增强免疫应答。由此，在过去的几年里，针对pd-1及其配体pd-l1的肿瘤免疫治疗已经取得了良好的临床疗效。

2、越来越多的临床研究表明，pd-l1在肿瘤细胞中的表达与该免疫疗法应答密切相关，肿瘤组织中高表达pd-l1的患者在该免疫疗法中的客观应答率较高。而且pd-l1蛋白磷酸化修饰是调控pd-l1蛋白水平的重要方式。例如，白细胞介素6激活杰纳斯激酶-1，并诱导pd-l1的y112位点磷酸化，从而招募内质网相关n-糖基转移酶stt3a使pd-l1糖基化，增强pd-l1稳定性。腺苷酸活化蛋白质激酶被二甲双胍激活后，在内质网腔与pd-l1直接结合，使pd-l1在s195位点磷酸化，导致pd-l1的异常糖基化及内质网相关降解。由此可见，pd-l1不同位点的磷酸化会导致不同的效应，进一步解析基于磷酸化的分子网络有助于我们更加深入地理解pd-l1蛋白水平的调控机制，为提升抗pd-1/pd-l1的疗效提供更为全面的依据。目前，在pd-l1磷酸化和肿瘤相关研究中存在如下技术问题：现有pd-l1磷酸化抗体少、特异性差。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明首先提供了磷酸化pd-l1的t290位点特异性抗体，该抗体能检测出人pd-l1蛋白磷酸化水平以及评估肝癌患者的预后，有助于研究pd-l1蛋白磷酸化对于肿瘤发生发展的影响，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，同时也为肿瘤的预后检测及评估提供了可能及其制备方法和应用。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体，所述抗体为人体pd-l1蛋白t290位点磷酸化多克隆抗体，所述pd-l1蛋白t290位点序列如seq id no.2所示。

4、一种所述磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)合成多肽：根据pd-l1蛋白t290位点序列seq id no.2合成修饰性肽段p-t290:cskkqsdthleet(p)和非修饰性肽段p-t290-c:cskkqsdthleet各10mg，所述多肽的氨基酸序列如seq id n0.1所示；

6、(2)制备抗原：取步骤(1)所述的修饰性肽段偶联载体蛋白钥孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin，klh)得到klh-多肽，制得抗原；

7、(3)制备抗体：将步骤(2)中的klh-多肽作为抗原对动物进行免疫，收集抗血清；

8、(4)对抗血清进行纯化和选择，即为pd-l1蛋白t290位点磷酸化抗体。

9、进一步地，步骤(3)所述的对动物进行免疫处理至少包括4次。

10、进一步地，免疫处理后还包括抗血清效价检测步骤，采用elisa方法检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：40000，则效价达到要求，若未达到，则增加1-2次免疫。

11、进一步地，步骤(4)所述的对抗血清进行纯化利用巯基偶联柱进行，采用elisa实验确定纯化后的抗血清是否能特异性识别人pd-l1蛋白t290位点磷酸化。

12、本发明还提供了上述的磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用。

13、本发明还提供了上述的磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体在制备肝癌预后标志物中的应用。

14、本发明的有益效果在于：

15、本发明的技术方案中列出人体pd-l1蛋白t290位点磷酸化抗体、其半抗原合成肽以及两者的制备方法，人pd-l1蛋白t290位点磷酸化抗体能检测出人pd-l1蛋白磷酸化水平以及评估肝癌患者的预后。本发明有助于研究pd-l1蛋白磷酸化对于肿瘤发生发展的影响，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，同时也为肿瘤的预后检测提供了可能。

16、pd-l1蛋白t290位点的磷酸化修饰能够有效降低肿瘤细胞pd-l1蛋白表达水平，阻断pd-1/pd-l1信号通路，抑制肿瘤的发生与发展。对人pd-l1蛋白t290位点磷酸化水平的检测将有助于临床进一步评估肿瘤患者的预后。

技术特征：

1.一种磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体，其特征在于，所述抗体为人pd-l1蛋白t290位点磷酸化多克隆抗体，所述pd-l1蛋白t290位点序列如seq id no.2所示。

2.一种权利要求1所述磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的对动物进行免疫处理至少包括4次。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，免疫处理后还包括抗血清效价检测步骤，采用elisa方法检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：40000，则效价达到要求，若未达到，则增加1-2次免疫。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的对抗血清进行纯化利用巯基偶联柱进行，采用elisa实验确定纯化后的抗血清是否能特异性识别人pd-l1蛋白t290位点磷酸化。

6.在先任一权利要求所述的磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体在制备肿瘤免疫药物中的应用。

7.在先任一权利要求所述的磷酸化人体pd-l1蛋白特异性抗体在制备肝癌预后标志物中的应用。

技术总结
本发明公开了磷酸化人体PD‑L1蛋白特异性抗体及其制备方法和应用。所述特异性抗体为人体PD‑L1蛋白T290位点磷酸化多克隆抗体，所述PD‑L1蛋白T290位点序列如SEQ ID NO.2所示。人PD‑L1蛋白T290位点磷酸化抗体能检测出人PD‑L1蛋白磷酸化水平以及评估肝癌患者的预后。因此，本发明有助于研究PD‑L1蛋白磷酸化对于肿瘤发生发展的影响，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，同时也为肿瘤的预后检测提供了可能。

技术研发人员：马海洁,吕雷,王婕,张若男,吴逸昕
受保护的技术使用者：舟山医院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1