一种突变型BstDNA聚合酶大片段及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及bst dna聚合酶突变体的截短体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、bst dna聚合酶是一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属(geobacillusstearothermophilus)dna聚合酶，基因全长2631bp，氨基酸序列全长876aa，蛋白分子量大小为99kda，等电点为5.32。完整的bst dna聚合酶具备四种活性：5 '-3 '外切酶活性、5 '-3 'dna聚合酶活性、3 '-5 '外切酶活性（校正活性）、链置换活性，c端肽链由291-876位氨基酸组成，执行除5 '-3 '外切酶活性外的其余3种酶活性，称为bst dna聚合酶大片段。bstdna聚合酶最适反应温度为65℃，在温度高于80℃时失活，因此不能用于热循环测序或pcr，具有抗逆性强，热稳定好，对非离子表面活性剂和高盐耐受性高等特点。

2、基于bst dna聚合酶的上述特性，该酶应用于富含gc碱基对的dna测序、低含量模板dna的快速测序、dna的等温扩增、多重链置换扩增和全基因组扩增。此外，bst dna聚合酶还能启动模板依赖的dna合成，在3 '末端随机添加核苷酸。近年来，核酸等温扩增技术发展迅猛，主要包括滚环扩增（rolling circle amplifi-cation，rca）技术和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）技术，bst dna聚合酶是这两种技术的基础用酶。由于bst dna聚合酶在恒温条件下就可以进行扩增反应，因此普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，相较于常规pcr检测，不依赖昂贵的pcr仪和专业实验室，检测时间短（仅为pcr技术的1/3-1/5），优势明显，因此广泛应用于医学检测、病原微生物的检验检疫，食品检疫等各个领域。bst dna聚合酶应用的另一个方向为二代测序，同样由于其可在恒温条件下扩增的优势，减少了文库扩增过程中循环升降温的步骤，提升了扩增效率，减少了测序时间，现有采用bst dna聚合酶的测序平台包括roche、illumina、solexa等。

3、目前虽然bst dna聚合酶已经商业化，相较于国外商品酶，国内市场bst dna聚合酶质量参差不齐，国产化进程缓慢，主要从国外各个生物公司购置，虽然该方法操作简单、快捷，但价格昂贵。若能构建bst dna聚合酶基因表达工程菌，自行合成bst dna聚合酶，可大幅降低科研及生产成本，也有利于bst dna聚合酶的国产化。现有技术中，制备bst dna聚合酶的方法无法上清表达，纯化成本高，且产物活性较差。因此本领域亟需开发低成本的有利于上清表达产物活性高的bst dna聚合酶制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种bst dna聚合酶突变体的截短体。

2、本发明的另一目的在于提供一种bst dna聚合酶突变体的截短体的制备方法。

3、本发明的另一目的在于提供编码bst dna聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列。

4、本发明的另一目的在于提供与编码bst dna聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列适配的载体。

5、本发明的另一目的在于提供含有编码bst dna聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列的试剂盒。

6、为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了bst dna聚合酶突变体的截短体，所述bst dna聚合酶突变体的截短体的氨基酸序列选自以下任一种：

7、（i）如seq id no.2所示序列的氨基酸序列；和

8、（ii）与如seq id no.2所示序列的同源性大于95%的氨基酸序列。

9、本发明的第二方面，提供了一种编码bst dna聚合酶突变体的截短体的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

10、（i）如seq id no.1所示序列的多核苷酸；

11、（ii）与如seq id no.1所示序列的同源性大于95%的多核苷酸；和

12、（iii）与（i）或（ii）中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

13、本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第二方面提供的多核苷酸。

14、在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pet-28a(+)。

15、本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第三方面提供的表达载体；或者

16、所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第二方面提供的多核苷酸。

17、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌（escherichia coli）。

18、在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)菌株。

19、本发明第五方面提供了一种制备bst dna聚合酶突变体的截短体的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

20、分离所述目的蛋白，即得所述bst dna聚合酶突变体的截短体；

21、在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第二方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。

22、在一些优选的方案中，使用sb、tb、lb、soc培养基培养所述的宿主细胞，更优选为使用tb或lb培养基培养所述的宿主细胞。

23、在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。

24、在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞。

25、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。

26、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。

27、在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至od600在0.6至0.8，后使用iptg进行诱导，以表达出目的蛋白。

28、在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：

29、将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。

30、在一些优选的方案中，所述层析柱为ni-柱亲和层析柱（ni-nta）。

31、在一些优选的方案中，所述流动相包括buffer a、buffer b和buffer c，每个buffer中均包含磷酸钠、nacl和咪唑。

32、在一些优选的方案中，所述buffer a中包含20mm磷酸钠，500mm nacl，20mm咪唑。

33、在一些优选的方案中，所述buffer b中包含20mm磷酸钠，500mm nacl，500mm咪唑。

34、在一些优选的方案中，所述buffer a中包含20mm磷酸钠，1m nacl。

35、在一些优选的方案中，所述buffer a、buffer b和buffer c的ph值均为7.4。

36、在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤还包括：

37、使用离子交换柱处理收集的洗脱液，得到处理液。

38、在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤还包括：对处理液进行透析。

39、本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的bst dna聚合酶突变体的截短体；或者

40、如本发明第二方面提供的多核苷酸；或者

41、如本发明第三方面提供的表达载体；或者

42、如本发明第四方面所述的宿主细胞。

43、本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

44、（1）本发明提供了bst dna聚合酶突变体的截短体，其耐热性良好，能够在大肠杆菌体系中稳定表达；

45、（2）本发明提供的bst dna聚合酶突变体的截短体的制备方法，能够大量表达可溶性bst dna聚合酶，纯化成本低，产物活性好，适宜工业化生产。

46、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。