一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法及其应用

本发明涉及酶固定化，尤其涉及一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法及其应用。

背景技术：

1、漆酶因其广泛的底物和多样的功能而成为近期的热门研究。通过漆酶催化反应产生的还原产物只有水，这使它成为一种绿色环保型酶。因此，漆酶在造纸产业、食品工业、生物检测和环境修复等方面有广泛应用。在造纸工业上，木质素决定纸浆的颜色，漆酶可以通过去除木质素来助于纸浆漂白。漆酶还能够替代二氧化氯处理废水，从而在一定程度上有助于减少有机氯化合物的产生。在食品工业上，果汁中酚类化合物的残留物会破坏果汁的质量和稳定性，而漆酶可以氧化酚类化合物，因此被人们广泛应用于果汁澄清。

2、尽管在工业环境中使用漆酶具有许多优点，但诸如酶在不同环境条件下(如ph、离子强度和温度)的不稳定性、蛋白水解，抑制剂灭活以及难以从反应混合物中分离酶等这些缺点，限制了漆酶进一步用于工业应用。此外，因处理过的游离酶难以重复使用，其高成本限制了实际应用。但这些缺点可以通过酶固定化技术来克服。理想的固定化酶有望表现出更高的催化活性和出色的重复利用性，并且在使用和储存过程中具有更高的稳定性。传统的固定化技术，如吸附、共价结合、交联、包埋等，虽然可以提高重复利用性和稳定性，但固定化后的酶的活性往往明显低于游离酶。

3、因此，如何克服游离漆酶稳定性差及传统漆酶固定化方法的缺点，找寻一种操作简单、成本低、稳定性好且酶活提高的固定化漆酶制备方法，是本领域技术人员急需解决的问题。

技术实现思路

1、本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法及其应用。本发明解决了传统漆酶固定化技术操作复杂，成本高，固定化后酶活低于游离酶的技术问题，制备得到的仿生物矿化固定化漆酶稳定性和酶活性均得到了显著提高。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)将酶液与金属盐溶液混合后，加缓冲液，搅拌，得到混合溶液；

5、(2)混合溶液超声后离心，所得沉淀经清洗、干燥，得到仿生物矿化固定化漆酶。

6、进一步地，步骤(1)中，所述酶液为漆酶酶液；所述漆酶来源于地衣芽孢杆菌，所述漆酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7、seq id no.1：

8、mrgsgsntynpfrldapsmllieewnqtaetggavtagfttknggeseppfhslntglhvqdheqhvinnrkkvadilktdlhdwvfadqthedrihkvtdgdrasgafrydtalkatdglytdrpnlflalcfadcvpvyfydpvrslvgiahagwkgtalgiaasmvdmwirregsnpadiravigpaigsacytvddhvidkirnlplqqedkafltikegeyrlelkevnrqllvhagipngqievsslctccerslffshrrdrgktgrmmsfiglkev

9、进一步地，步骤(1)中，所述金属盐溶液为镍盐溶液。

10、进一步地，所述镍盐包括氯化镍、硝酸镍、硫酸镍中的一种。

11、进一步地，步骤(1)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述混合溶液中，漆酶的浓度为0.01～0.2mg·ml-1，镍盐的浓度为1～3mmol·l-1，镍盐与磷酸盐的摩尔比为1～3:20，所述混合溶液的ph为7.4～7.6。

12、进一步地，步骤(1)中，所述搅拌的速度为200～500r/min，时间为3～5min。

13、进一步地，步骤(2)中，所述超声的频率为40khz，功率为100w，时间为1～15min。

14、进一步地，步骤(2)中，所述离心的速度为10000～16000r/min，时间为5～10min，温度为2～6℃，所述清洗为使用超纯水清洗，所述干燥为冷冻干燥，温度为-20～-10℃，时间为10～18h。

15、进一步地，所述制备方法制备的仿生物矿化固定化漆酶。

16、进一步地，所述的仿生物矿化固定化漆酶的应用，所述仿生物矿化固定化漆酶作为催化剂用于催化多酚、芳香族化合物发生氧化反应。

17、本发明有益的技术效果在于：

18、本发明采用仿生物矿化法来固定化漆酶，与游离酶相比，该固定化漆酶催化活性、热稳定性和ph稳定性均得到增强，重复利用性较优。这一方面是因为仿生物矿化固定化后，所形成的结构相对于游离酶具有更大的比表面积，提高了固定化酶的催化活性；另一方面，由于固定化后，游离酶外部包裹的无机盐有效隔绝了恶劣环境对蛋白质的直接影响，因此热稳定性和ph稳定性有了较大的提升。

19、本发明通过优化漆酶浓度、超声时间、金属离子种类大大提升了固定化漆酶的酶活力回收率。与传统的漆酶固定化技术，如吸附、共价结合、交联、包埋等相比，传统的漆酶固定化技术虽然可以提高重复利用性和稳定性，但操作步骤较为繁琐，固定化成本较高。本发明提供了一种漆酶的快速固定化方法，过程中使用超声法辅助制备固定化酶，不仅显著加快固定化时间，相对于传统固定化方法所需时间至少1小时以上的情况，本发明仅数分钟即可形成固定化酶。此外，相对于传统固定化材料，本发明仅需提供镍离子与漆酶混合，在磷酸盐缓冲液体系中即可发生自组装行为形成固定化酶，固定化成本较为低廉。综上所述，本发明是一种高效的漆酶固定化方法。

技术特征：

1.一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶液为漆酶酶液；所述漆酶来源于地衣芽孢杆菌，所述漆酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述金属盐溶液为镍盐溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述镍盐包括氯化镍、硝酸镍、硫酸镍中的一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述混合溶液中，漆酶的浓度为0.01～0.2mg·ml-1，镍盐的浓度为1～3mmol·l-1，镍盐与磷酸盐的摩尔比为1～3:20，所述混合溶液的ph为7.4～7.6。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述搅拌的速度为200～500r/min，时间为3～5min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声的频率为40khz，功率为100w，时间为1～15min。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心的速度为10000～16000r/min，时间为5～10min，温度为2～6℃，所述干燥为冷冻干燥，温度为-20～-10℃，时间为10～18h。

9.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制备的仿生物矿化固定化漆酶。

10.一种权利要求9所述的仿生物矿化固定化漆酶的应用，其特征在于，所述仿生物矿化固定化漆酶作为催化剂用于催化多酚、芳香族化合物发生氧化反应。

技术总结
本发明公开了一种仿生物矿化固定化漆酶的制备方法及其应用。本发明所述仿生物矿化固定化漆酶是利用漆酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成漆酶‑无机盐纳米微球。相较于传统的固定化技术，本发明操作条件更加温和，负载率高，是一种廉价且对环境无害的漆酶固定化技术。与游离漆酶相比，本发明的固定化漆酶不仅可以保持其催化特性，而且可以弥补游离漆酶的缺点，具有稳定性强、重复回收利用率高和长期使用等优点，为漆酶在环境、医药及食品等领域的应用奠定了基础。

技术研发人员：张梁,辛瑜,郭自涛,黄爱敏,顾正华,郭忠鹏,李默影,朱瑞
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15