一种体外转导增强剂及感染效力检测方法与流程

本发明涉及生物，具体地涉及一种体外转导增强剂及感染效力检测方法。

背景技术：

1、近10年来，腺相关病毒（aav）介导的基因疗法在治疗遗传性单基因疾病方面显示出了巨大的潜力，越来越多的基于aav载体的基因治疗药物产品进入临床开发。目前全球已有7种aav载体药物获批上市。基因治疗开发过程中具有挑战性的方面之一是载体效力的表征和量化，这是产品质量控制的关键方法之一，也是aav载体药品上市申请所必需的。

2、对于raav制品的效力测定方法，应体现其病毒物理滴度、感染活性及生物活性。一般在临床试验早期可采用qpcr法测定病毒物理滴度，敏感细胞或靶向细胞测定其感染活性和目标产物表达能力表征生物活性。关键性临床试验开展后应进一步开发反映产品作用机制的体外酶活法或体内功能实验法。

3、体内功能实验法一般需要相对应的模型动物，与aav基因疗法适应症的广泛性相比，模型动物是比较缺乏的。并且动物实验的周期较长，不同批次动物可能存在个体差异，这些都使得体内效力测试方法难以验证和标准化。同时体内效力评估是一个耗时且劳动密集的过程，导致成本高昂并增加引入变异的风险。

4、aav载体体外效力评估方法会减少测试时间和所需载体用量以降低检测成本，且由于体外培养细胞的同质性，预期会提高方法的重复性。此外，aav载体体外效力评估方法也符合欧盟关于保护用于科学目的的动物实验取代、减少和完善的原则。

5、aav9体外转导293t细胞比较困难，通常需要使用大量的病毒在非常高的moi条件下才能实现较为理想的基因表达水平。moi越高则病毒体积越大，细胞实验中加入病毒体积受培养基体积限制不能无限增加，故检测方法的范围受限。细胞实验中高moi则需要高滴度的aav载体，这也对病毒的纯化工艺提出一些挑战。

6、因此，本领域亟需开发一种可以提高载体体外转导的制剂和效力检测的新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种体外转导增强剂及感染效力检测方法。

2、本发明第一方面提供了一种体外转导增强剂，包括：神经氨酸酶（na）、丁酸钠（nabu）、多聚赖氨酸（poly-lysine）中的一种或多种。

3、在另一优选例中，所述体外转导增强剂包括神经氨酸酶（na）、丁酸钠（nabu）、多聚赖氨酸（poly-lysine）中的两种或两种以上的组合。

4、在另一优选例中，所述体外转导增强剂包括丁酸钠和多聚赖氨酸的组合。

5、在另一优选例中，所述体外转导增强剂包括丁酸钠和神经氨酸酶的组合。

6、在另一优选例中，所述体外转导增强剂包括多聚赖氨酸和神经氨酸酶的组合。

7、在另一优选例中，所述体外转导增强剂包括多聚赖氨酸、神经氨酸酶和丁酸钠的组合。

8、在另一优选例中，所述多聚赖氨酸（poly-lysine）包括多聚d赖氨酸（pdl）。

9、在另一优选例中，所述神经氨酸酶（na）的酶活浓度为3-120 mu/ml，较佳地，5-110mu/ml，更佳地，6.25-100 mu/ml。

10、在另一优选例中，所述丁酸钠（nabu）的摩尔浓度为1-20 mm，较佳地，2.5-20 mm，更佳地，5-20 mm。

11、在另一优选例中，所述多聚赖氨酸（poly-lysine）的质量浓度为0.1-200 μg/ml，较佳地，0.5-150 μg/ml，更佳地，1-100 μg/ml。

12、在另一优选例中，所述体外转导增强剂用于增强载体对细胞的转导效率。

13、在另一优选例中，所述的载体包括病毒载体。

14、在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、dna病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。

15、在另一优选例中，所述载体是腺相关病毒aav载体。

16、本发明第二方面提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的体外转导增强剂。

17、在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或说明书。

18、本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述的体外转导增强剂的用途，用于制备增强载体对细胞的转导效率的组合物或试剂盒。

19、在另一优选例中，所述的载体包括病毒载体。

20、在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、dna病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。

21、在另一优选例中，所述载体是腺相关病毒aav载体。

22、在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

23、在另一优选例中，所述组合物还包括其他增强载体对细胞的转导效率的物质。

24、在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

25、在另一优选例中，所述组合物的剂型为液体制剂。

26、在另一优选例中，所述组合物的剂型为注射剂型。

27、本发明第四方面提供了一种物质的用途，用于制备用于基因治疗的药物，所述物质包括本发明第一方面所述的体外转导增强剂和一载体。

28、在另一优选例中，所述的载体包括病毒载体。

29、在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、dna病毒载体、逆转录病毒载体、或其组合。

30、在另一优选例中，所述载体是腺相关病毒aav载体。

31、本发明第五方面提供了一种增强载体对细胞的体外转导效率的方法，包括：

32、在本发明第一方面所述的体外转导增强剂的存在下，将细胞与载体接触。

33、在另一优选例中，所述细胞包括真核细胞。

34、在另一优选例中，所述细胞包括人或非人哺乳动物细胞。

35、在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。

36、在另一优选例中，所述的细胞包括：体细胞、干细胞、生殖细胞、非分裂细胞、或其组合。在另一优选例中，所述的细胞包括：肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。

37、在另一优选例中，所述细胞包括：293t细胞、293细胞、hek 293。。

38、在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

39、在另一优选例中，所述方法为体外的方法。

40、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

技术特征：

1.一种体外转导增强剂，其特征在于，包括：神经氨酸酶（na）、丁酸钠（nabu）、多聚赖氨酸（poly-lysine）中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述增强剂包括神经氨酸酶（na）、丁酸钠（nabu）、多聚赖氨酸（poly-lysine）中的两种或两种以上的组合。

3.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述增强剂包括丁酸钠和多聚赖氨酸的组合。

4.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述增强剂包括丁酸钠和神经氨酸酶的组合。

5.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述增强剂包括多聚赖氨酸和神经氨酸酶的组合。

6.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述增强剂包括多聚赖氨酸、神经氨酸酶和丁酸钠的组合。

7.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述多聚赖氨酸（poly-lysine）包括多聚d赖氨酸（pdl）。

8. 如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述神经氨酸酶（na）的酶活浓度为3-120 mu/ml，较佳地，5-110 mu/ml，更佳地，6.25-100 mu/ml。

9. 如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述丁酸钠（nabu）的摩尔浓度为1-20 mm，较佳地，2.5-20 mm，更佳地，5-20 mm。

10. 如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述多聚赖氨酸（poly-lysine）的质量浓度为0.1-200 μg/ml，较佳地，0.5-150 μg/ml，更佳地，1-100 μg/ml。

11.如权利要求1所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述转导增强剂用于增强载体对细胞的转导效率。

12.如权利要求11所述的体外转导增强剂，其特征在于，所述的载体包括病毒载体。

13.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的体外转导增强剂。

14.一种权利要求1所述的体外转导增强剂的用途，其特征在于，用于制备增强载体对细胞的转导效率的组合物或试剂盒。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的载体包括病毒载体。

16.一种物质的用途，其特征在于，用于制备用于基因治疗的药物，所述物质包括权利要求1所述的体外转导增强剂和权利要求11所述的载体。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的载体包括病毒载体。

18.一种增强载体对细胞的体外转导效率的方法，其特征在于，包括：

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞包括人或非人哺乳动物细胞。

技术总结
本发明涉及一种体外转导增强剂及感染效力检测方法，具体的，本发明提供了一种体外转导增强剂，包括：神经氨酸酶（NA）、丁酸钠（NaBu）、多聚赖氨酸（Poly‑Lysine）中的一种或多种。本发明首次发现，本发明的增强剂可以大大减少病毒或载体（比如病毒载体）的使用量，同时实现较好的效力检测效果，突破技术瓶颈，解决了本领域的技术障碍。

技术研发人员：吴昊泉,汪正亮,周群炜
受保护的技术使用者：康霖生物科技（杭州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1