一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法与流程

本申请涉及细胞培养，具体涉及一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法。

背景技术：

1、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，msc）是一类具有多向分化潜能及极强自我更新能力的成体干细胞，可在退行性疾病、创伤修复、自身免疫性疾病等多领域发挥重要作用。根据来源可依次分类为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。msc具有贴壁性，呈纤维状，来源珍贵。细胞贴壁的过程，细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面。然后，细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。因此，培养细胞贴壁时常依赖于供者状态，即供者不同脐带自身特性不同，由此贴壁情况质量不一，在多次传代过程中易造成不同程度的细胞损失。

2、为提高细胞的利用率，现有的促细胞贴壁技术多为通过改善培养容器表面吸附能力实现，改善方法包括物理方法和化学方法，物理处理主要通过射频真空等离子体、微波等离子体实现，化学处理主要通过应用吸附、接枝技术在固体基底表面施加吸附层实现，皆可在一定程度上允许细胞粘附到培养容器表面。

3、但是，经物理处理的培养容器表面亲水持久性较差，大概在半年左右，而化学处理的培养容器表面可能存在溶剂残留，细胞毒性较大。更为重要的是，对于贴壁难度较大的细胞，培养容器需额外添加胞外基质蛋白、胶原蛋白等成分来制备吸附层，该种吸附层制备耗时长，无法保证完全无菌，且储存寿命短。同样，应用现有的培养容器培养msc或多能干细胞衍生的msc时，弱粘附对培养方面有明显的限制。

4、现有技术中也会使用到粘连蛋白、转铁蛋白等物质来促进细胞贴壁，但其使用的条件有诸多限制。更为重要的是，某些种类的干细胞来源珍贵，如人源脐带间充质干细胞，提高细胞贴壁率可有效缩短细胞的收获时间，减少相应的试剂成本，减少原代细胞的损失，以及提高利用率。因此，需要一种能够促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足之处，本申请通过试验验证，得到了一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基及其制备方法，并可以广泛应用于组织块、细胞等培养过程涉及间充质干细胞生长的步骤中。

2、本申请是通过以下技术方案实现的：

3、本申请的其中一个发明点为提供一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括培养基本体，该培养基本体适于间充质干细胞生成。此外，所述培养基还包括额外添加于所述培养基本体中的血清和盐类添加剂，能够高效促进所述间充质干细胞贴壁生长。

4、进一步地，所述血清的用量小于等于培养基总体积的5%；所述盐类添加剂在所述培养基中的浓度不超过21000mg/l。

5、进一步地，所述盐类添加剂包括无机钠盐和/或无机钾盐，若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐的浓度大于钾盐的浓度。

6、进一步地，若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐浓度≥6150mg/l，所述钾盐浓度≥200mg/l；若含有钠盐，不含有钾盐，则所述钠盐浓度为6150~14000mg/l；若含有钾盐，不含有钠盐，则所述钾盐浓度为200~700mg/l。

7、进一步地，所述钠盐包括氯化钠、磷酸氢二钠和硫酸钠中的至少一种，所述钾盐包括磷酸二氢钾和/或硝酸钾。

8、进一步地，所述培养基本体为基础培养基，其包括无机盐、氨基酸、维生素和能量底物；所述基础培养基优选为dme/f-12、mem或dmem。

9、进一步地，所述培养基本体中若无机盐含有钠盐和/或钾盐，则钠盐和/或钾盐总浓度不超过7500mg/l；

10、所述培养基本体的无机盐包括氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌中的至少一种；

11、所述能量底物为d-葡萄糖和/或丙酮酸钠。

12、本申请的另一个发明点为提供一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂，所述制剂包括以上任意一段所述的血清和盐类添加剂。

13、本申请的另一个发明点为提供一种上述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基的制备方法，在无菌条件下，称取配制所述盐类添加剂的钠盐和/或钾盐，溶于水中混匀，滤膜过滤后保存，保存温度为2~8℃；使用时与所述基础培养基和血清混匀，得到所述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。

14、本申请的最后一个发明点为以上所述的培养基或制剂在促进间充质干细胞贴壁生长的应用。

15、本申请的有益效果如下：

16、1、本申请将血清和一定浓度的钠盐和/或钾盐添加到基础培养基中，促进msc贴壁生长，提高细胞贴壁率，缩短细胞的收获时间，减少了原代细胞的损失，提高了细胞利用率，并且对于msc以及多能干细胞衍生的msc具有很高的适用性。

17、2、本申请的制剂和培养基组分简单，产生的效果明显，不易造成污染，无副作用。

18、3、本申请培养基的制备方法简单易操作，促进msc贴壁生长同时实验成本低。相较于基础培养基中只添加血清的方法，根据本申请的血清使用量大幅减少，降低了实验及生产成本。

技术特征：

1.一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括培养基本体，该培养基本体适于间充质干细胞生长；其特征在于，还包括：

2.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，其特征在于，所述盐类添加剂若同时含有钠盐和钾盐，则所述钠盐浓度≥6150mg/l，所述钾盐浓度≥200mg/l；若含有钠盐，不含有钾盐，则所述钠盐浓度为6150~14000mg/l；若含有钾盐，不含有钠盐，则所述钾盐浓度为200~700mg/l。

3.根据权利要求1所述的一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，其特征在于，所述培养基本体为基础培养基，其包括无机盐、氨基酸、维生素和能量底物；所述基础培养基为dme/f-12、mem或dmem。

4.根据权利要求3所述的一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，其特征在于，在所述培养基本体中，若无机盐含有钠盐和/或钾盐，则钠盐和/或钾盐总浓度不超过7500mg/l；

5.一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1~4中任意一项所述的血清和盐类添加剂。

6.一种根据权利要求1~4中任意一项所述的促进间充质干细胞贴壁生长的培养基的制备方法，其特征在于，在无菌条件下，称取配制所述盐类添加剂的钠盐和/或钾盐，溶于水中混匀，滤膜过滤后保存，保存温度为2~8℃；使用时与所述基础培养基和血清混匀，得到所述促进间充质干细胞贴壁生长的培养基。

7.一种根据权利要求1~4中任意一项所述的培养基或权利要求5所述的制剂在促进间充质干细胞贴壁生长中的应用。

技术总结
本申请公开一种促进间充质干细胞贴壁生长的制剂、培养基及其制备方法。一种促进间充质干细胞贴壁生长的培养基，包括培养基本体，该培养基本体适于间充质干细胞生长。此外，所述培养基还包括额外添加于所述培养基本体中的血清和盐类添加剂，能够高效促进所述间充质干细胞贴壁生长。所述血清的用量小于等于培养基总体积的5%；所述盐类添加剂在所述培养基中的浓度不超过21000mg/L。本申请将血清和一定浓度的钠盐和/或钾盐添加到基础培养基中，促进MSC贴壁生长，提高细胞贴壁率，缩短细胞的收获时间，减少了原代细胞的损失，提高了细胞利用率，并且对于MSC以及多能干细胞衍生的MSC具有很高的适用性。

技术研发人员：王广基,苏月焱,尹璇,郭佳琪,蒲志青,张艺,罗燕,张月
受保护的技术使用者：江苏睿源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15