具有立体选择性的酯酶及其应用的制作方法

本申请涉及生物工程，尤其涉及一种具有立体选择性的酯酶及其应用。

背景技术：

1、(s)-氧杂环丁烷-2-甲酸是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛应用于手性合成领域，特别是在手性药物制备方面，也是药物的重要手性构建单元，如兼具治疗ii型糖尿病和肥胖症的danuglipron(pf-06882961)，其需求量在飞速的增长。由于氧杂环丁烷-2-甲酸酯连接到手性中心的两个取代基差异很小，很少有报道的酶具有对映体选择性来区分杂环羧酸酯的两个对映体。此外，由于手性中心两侧基团差异较小，使得通过手性助剂法化学拆分杂环羧酸酯也具有挑战性。因此鉴定具有高对映体选择性的新型酯酶，对于高效合成手性氧杂环羧酸及其衍生物，阐明酯酶对映体选择性的分子机理具有重要意义。

2、用于生物法制备(s)-氧杂环丁烷-2-甲酸及(s)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分氧杂环己烷-2-甲酸酯这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在氧杂环丁烷-2-甲酸酯中的应用奠定良好的基础。

3、酯酶(esterases，ec 3.1.1.1)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等。这些野生菌中酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产酯酶具有十分重要意义。因此针对氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯化合物，亟需筛选高效和高选择性的生物催化剂，以满足工业需要。

技术实现思路

1、本申请针对现有的生物催化动力学拆分氧杂环丁烷-2-甲酸酯制备(s)-氧杂环丁烷-2-甲酸甲酯的反应中，可提供该反应的酯酶报道较少的问题，提供一种具有优异的不对称催化活性、立体选择性好的酯酶及其应用，所述酯酶的立体选择性好，光学纯度高，具有很好的工业应用价值。

2、本申请具体技术方案如下：

3、1.一种具有立体选择性的酯酶，所述酯酶为：

4、a)包含如seq id no:2所示的序列或者如seq id no:2所示的序列；或者

5、b)包含一个或两个以上突变的基于seq id no:2的突变体。

6、2.根据项1所述的酯酶，其中，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no:2的v144、s148和e149中的至少一个位点的氨基酸突变，优选包含对应于seq id no:2的v144、s148和e149位点的氨基酸突变。

7、3.一种具有立体选择性的酯酶，其包含如seq id no:4所示的序列或者如seq idno:4所示的序列。

8、4.一种核酸分子，其编码项1-3中任一项所述的酯酶。

9、5.根据项4所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含seq id no:1或seq id no:3所示的序列或者如seq id no:1或seq id no:3所示的序列。

10、6.一种表达载体，其包含项4或5所述的核酸分子。

11、7.根据项6所述的表达载体，所述表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

12、8.一种宿主细胞，其包含项6或7所述的表达载体。

13、9.根据项8所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

14、10.项1-3中任一项所述的酯酶、项4或5所述的核酸分子、项6或7所述的表达载体或者项8或9所述的宿主细胞在生产手性氧杂环烷烃甲酸酯中的应用。

15、11.一种生产手性氧杂环烷烃甲酸酯的方法，包括：

16、使用项1-3中任一项所述的酯酶拆分氧杂环烷烃甲酸酯类化合物得到手性环烷烃甲酸酯。

17、12.根据项11所述的方法，所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物的结构式如式(i)所示：

18、

19、其中，n为1-3中的任意整数，r为包括甲基、乙基、异丙基或苯基的基团。

20、发明的效果

21、本申请的酯酶作为催化剂在不对称拆分制备手性氧杂环烷烃甲酸酯的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。

技术特征：

1.一种具有立体选择性的酯酶，所述酯酶为：

2.根据权利要求1所述的酯酶，其中，所述突变体的氨基酸序列包含对应于seq id no:2的v144、s148和e149中的至少一个位点的氨基酸突变，优选包含对应于seq id no:2的v144、s148和e149位点的氨基酸突变。

3.一种具有立体选择性的酯酶，其包含如seq id no:4所示的序列或者如seq id no:4所示的序列。

4.一种核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的酯酶。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含seq id no:1或seq idno:3所示的序列或者如seq id no:1或seq id no:3所示的序列。

6.一种表达载体，其包含权利要求4或5所述的核酸分子；

7.一种宿主细胞，其包含权利要求6或7所述的表达载体；

8.权利要求1-3中任一项所述的酯酶、权利要求4或5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞在生产手性氧杂环烷烃甲酸酯中的应用。

9.一种生产手性氧杂环烷烃甲酸酯的方法，包括：

10.根据权利要求9所述的方法，所述氧杂环烷烃甲酸酯类化合物的结构式如式(i)所示：

技术总结
本申请公开了一种具有立体选择性的酯酶及其应用，所述酯酶为：a)包含如SEQ ID NO:2所示的序列或者如SEQ ID NO:2所示的序列；或者b)包含一个或两个以上突变的基于SEQ ID NO:2的突变体，所述酯酶作为催化剂在不对称拆分制备手性氧杂环烷烃甲酸酯的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ees值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用开发前景。

技术研发人员：王武宝,胡廷峰,孙方刚,刘刚,高小飞
受保护的技术使用者：济南尚博医药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19