病毒样颗粒制备方法与流程

本发明涉及动物疫苗制备领域，具体的涉及一种圆环病毒样颗粒制备方法。

背景技术：

1、pcv2型(porcine circovirus type 2，pcv2)是一种圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属病毒，1991年首次在加拿大的猪群中分离得到，目前pcv2的基因型分为：pcv2a、pcv2b、pcv2c、pcv 2d(mpcv 2b)。pcv2为无囊膜、单股环状双向dna病毒，约含1767～1768个核苷酸，分子量为5.8×102。病毒粒子直径平均为17nm，对酸性环境(ph3)、氯仿或高温(56℃和70℃)有抵抗能力，病毒的dna利用宿主细胞的酶自行复制。pcv2可经口腔、呼吸道途径感染不同日龄的猪，病猪所接触的物品或病猪的分泌物可能含有传染性病原体。

2、pcv2已成为危害养猪业的主要疫病之一，在猪群中感染率较高，怀孕母猪感染pcv2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪，并导致繁殖障碍。断奶仔猪pcv2感染后会出现多系统消耗综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、肉芽肿性肠炎、急性肺水肿和增生性坏死性肺炎等多种疾病。现有技术已经证实，pcv2主要危害是能够破坏猪体的免疫系统，导致免疫抑制及机体抵抗力降低，干扰和破坏猪对其他病原微生物的免疫抗体的产生和维持，从而继发其他疾病，因此pcv2的危害性除了其本身导致的疾病外，还与其它重要疾病，例如猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪副嗜血杆菌病、猪肺炎支原体病、猪链球菌病等多种疾病的混合、继发感染有密切关系，pcv2的预防控制对于养猪业有极为重要的意义。

3、疫苗是防控pcv2的有效工具，免疫接种可以有效减少pcv2对免疫猪的危害程度。目前市场上的pcv2疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种：全病毒灭活苗由于病毒自身特点和生产工艺的弊端，存在病毒滴度低、有效抗原纯度低等问题，且免疫接种后存在多种不同程度的副反应。亚单位疫苗主要是使用真核或原核表达系统高效表达pcv2的cap蛋白，作为抗原使用。而部分技术报道的cap蛋白经自组装形成的病毒样颗粒(virus-likeparticle，vlp)，经纯化后可制备得到病毒样颗粒疫苗，vlp的形态结构与天然病毒高度相似，免疫原性良好，且不含有病毒基因，因此是一种理想的疫苗形式。

4、目前，圆环病毒vlp的纯化方式主要包括离心、透析、层析、离子交换等方法，在大肠杆菌中表达的无融合标签cap蛋白，可自发形成vlp，但存在表达量低、胞内表达、低溶解度的问题，导致组装效率偏低。且在后续纯化过程需要细胞裂解，释放vlp颗粒步骤，例如专利cn106754764a中公开的一种圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化方法，其主要步骤包括：用冻融和超声处理手段将病毒裂解，利用滤板去除细胞碎片澄清处理后，用中空纤维膜系统将其浓缩8-12倍，得到病毒浓缩液，再利用分子筛层析纯化系统进行纯化，操作步骤繁琐，需要反复置换缓冲液，多层过滤和浓缩，耗费大量设备和材料、人工和时间。例如专利cn108611327a中公开的猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，包括如下步骤：步骤s1，收集重组酵母细胞并进行破碎，获得含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞裂解液；步骤s2，对细胞裂解液进行澄清获得病毒样颗粒初提液；步骤s3，对病毒样颗粒初提液进行离子交换层析获得病毒样颗粒粗纯液；步骤s4，对病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩获得病毒样颗粒浓缩液；步骤s5，对病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒。该方法在细胞裂解后经过反复的澄清初提、离子交换层析、超滤浓缩、凝胶层析的纯化过程，步骤更多，涉及的设备和材料更为复杂，耗时更长，难以实现规模化应用。

5、现有技术中还有的在cap蛋白的n端插入sumo融合标签，来提高表达效率，将表达的蛋白去标签后，再通过超滤浓缩的方法将料液缓冲液置换为组装缓冲液进行纯化后，再将纯化的cap蛋白组装成vlp。这一过程同样会涉及到酶切缓冲液、组装液、缓冲液的置换等繁杂的步骤，通常需要耗费大量人力物力和时间。

6、因此提供一种能够高效完成pcv2的病毒样颗粒的澄清和组装的方法是本领域亟待解决的问题，有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种pcv2病毒样颗粒的澄清和组装的方法，该方法步骤简单、操作方便、成本低，且能够有效去除杂蛋白和细胞碎片，促进vlp组装。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种pcv2病毒样颗粒制备方法，其步骤为：

4、1)收获圆环2型cap蛋白的细胞培养液；

5、2)在无菌条件下，向培养液中加入酸溶液将ph调至小于等于6.5；

6、3)将ph调节后的培养液加热处理。

7、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，其中所述的ph优选为5.5。

8、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，其中所述的酸溶液为盐酸、乙酸、柠檬酸、甲酸，优选为盐酸。

9、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，其中所述的加热温度大于等于45℃，优选为45℃-56℃。

10、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，其中所述的加热时间为0.5h-10h，优选为3h-6h。

11、在一些实施方案中，所述的步骤3)中培养液在45℃下加热6h处理。在一些实施方案中，所述的步骤3)中培养液在56℃下加热3h处理。

12、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，其中所述步骤3)中还可以包含搅拌步骤。

13、根据本发明提供的pcv2病毒样颗粒制备方法，所述搅拌速度可以为100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm，所述搅拌的目的是使得混合和加热均匀。

14、进一步地，本发明中pcv2病毒样颗粒制备方法还可选地包括以下步骤：将处理得到的培养液恢复至室温后，离心取上清，可选的进行后续纯化处理。

15、进一步地，本发明中pcv2病毒样颗粒制备方法还可以包含层析纯化步骤。

16、在本发明的一些实施方案中，所述层析纯化步骤为离子交换层析。

17、优选地，所述层析纯化步骤为离子交换层析，更优选地，所述层析纯化步骤为阳离子交换层析。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、1)本发明提供的方法步骤简单、无需高速离心、多层过滤等复杂步骤，大大降低了操作难度，减少操作时间、降低成本。

20、2)本发明提供的方法能够在目的蛋白含量不受影响的情况下，有效去除料液中的杂蛋白，显著降低料液的浊度。

21、3)本发明提供的方法vlp组装效率高，vlp含量是其它方法的4倍左右，效果极其显著，且对vlp的结构和免疫原性没有影响。

22、4)本发明提供方法制备得到的vlp保存时间长，保存率更高，稳定性远高于其它方法。

技术特征：

1.一种病毒样颗粒制备方法，其步骤为：

2.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述的ph优选为5.5。

3.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述加热温度大于等于45℃。

4.根据权利要求3中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述加热温度为45℃-56℃。

5.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述步骤3)中培养液在45℃下加热6h。

6.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述步骤3)中培养液在56℃下加热3h。

7.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述的酸溶液为盐酸、乙酸、柠檬酸、甲酸。

8.根据权利要求7中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述的酸溶液为盐酸。

9.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，所述的病毒样颗粒为pcv2病毒样颗粒。

10.根据权利要求1中所述的病毒样颗粒制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将处理得到的培养液恢复至室温后，离心取上清，可选的进行后续纯化处理。

技术总结
本发明涉及一种圆环病毒样颗粒制备方法，该制备方法包含以下步骤：1)收获cap蛋白的细胞培养液；2)在无菌条件下，向培养液中加入酸溶液将pH调至小于等于6.5；3)将pH调节后的培养液加热处理。本发明提供的方法步骤简单、无需高速离心、多层过滤等复杂步骤，大大降低了操作难度，减少操作时间、降低成本；且提高VLP含量和组装效率，保存时间长，保存率更高，稳定性高。

技术研发人员：贺笋,辛菲,黎明,蔡清波,杨延丽
受保护的技术使用者：天康制药股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8