一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法

本发明涉及生物工业催化领域，更具体的说，是涉及一种多酶协同催化剂的制备方法。

背景技术：

1、多酶复合体(multienzyme complex)是指催化一系列相关反应的多种酶相互嵌合而形成的结构和功能性实体。在细胞内的天然多酶复合体中，酶分子之间的临近效应与底物通道效应使得多种细胞代谢过程有序高效进行，对维持细胞代谢水平至关重要。基于天然多酶复合体的发现与研究，研究者们也尝试通过构建人工多酶复合体在细胞内建立新的合成路径。尽管细胞能为酶提供适宜的催化条件以及所需的电子受体或供体，但复杂的细胞内环境往往存在竞争反应；同时，不同来源的酶在宿主细胞内表达与活性差异以及新引入的代谢途径可能产生的细胞代谢失衡往往制约着细胞内构建人工多酶复合体的发展。因此，体外构建人工多酶复合体逐渐成为多酶级联反应以及协同催化的研究热点。目前研究已经开发出了多种方法用于体外多酶复合体的构建，然而其构建过程仍存在挑战，主要在于多酶复合体的体外组装较为困难。

2、spytag/spycatcher(st/sc)系统是一种自发性共价连接分子对，st与sc可在中性条件下形成稳定的异肽键，在生物材料制备、免疫实验、生物催化中具有重要应用。该st/sc共价连接系统为多酶复合体的组装提供了更为有效且稳定的结合；然而，在当采用该系统在固相载体表面进行多酶复合体的组装时，其组装效率低于游离状态下的组装。在此过程中，酶分子在载体表面的取向与空间位阻将直接影响st与sc的结合效率，导致组装较为困难。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服在固相载体表面组装多酶复合体较为困难的问题，提出了一种在磁珠表面通过亲和作用协同多酶自组装形成复合体的方法，可实现酶与酶之间的有效结合，提高载体表面多酶复合体的组装效率。

2、本发明的具体技术方案如下：

3、一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，包括如下步骤：

4、步骤1、构建分别带有st与sc的重组蛋白，并分别在表达宿主菌中进行表达；破碎表达有重组蛋白的细胞，获得粗酶液；

5、步骤2、制备表面修饰有亲和配体的磁珠；

6、步骤3、利用步骤2制备的亲和磁珠直接从步骤1的粗酶液中预先亲和吸附一种重组蛋白；

7、步骤4、将步骤3中亲和吸附有一种重组蛋白的磁珠与含有另一种重组蛋白的粗酶液混合进行，两种蛋白在磁珠表面通过st与sc的作用发生共价连接形成复合体。

8、进一步地，步骤1中，通过基因工程方法，将sc基因与所选取的第一种酶(e1)的基因融合并连接到表达载体上构建重组质粒pet-e1-sc；再将spytag基因与第二种酶(e2)的基因融合，构建重组质粒pet-e2-sc；然后将两种重组质粒分别转化进入表达宿主菌，进行细胞培养并诱导蛋白表达；低温条件下破碎细胞并离心除去细胞碎片，分别得到含有e1-sc与e1-sc的粗酶液。

9、进一步地，步骤2中，将表面修饰有环氧基团的磁珠与亲和配体进行偶联；

10、进一步地，步骤3中，步骤2中制备的亲和磁珠与步骤1中含有e1-sc的粗酶液混合，4～25℃振荡反应10～60min，反应结束后，磁分离，得到亲和吸附有e1-sc的磁性微球；

11、进一步地，步骤4中，步骤3中吸附有e1-sc的磁性微球与步骤1中含有e2-sc的粗酶液混合，4～25℃振荡反应0.5～30h，反应结束后，磁分离，得到负载有e1-sc/e2-sc的磁性多酶复合体；

12、进一步地，步骤1中构建的重组蛋白均带有亲和标签，所述亲和标签包括his-tag、flag-tag、strep-tagⅱ、gst、mbp等；

13、进一步的，步骤1中构建的重组蛋白中，st与sc位于融合蛋白的n末端，或位于融合蛋白的c末端；

14、进一步地，步骤1中构建的重组蛋白中，亲和标签与st或sc位于同一末端，或分别位于融合蛋白的两个末端，或位于st/sc与酶之间；

15、进一步地，步骤1中，酶与st或sc之间的间隔臂(linker)为5～45个氨基酸，所述间隔臂为甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的组合，或者所述间隔臂为谷氨酸(e)、丙氨酸(a)、甘氨酸(g)和脯氨酸(p)的组合；

16、进一步地，步骤2中，所述微球表面基团为环氧基、氨基、羧基和醛基；

17、进一步地，步骤2中，所述微球表面修饰的亲和配体为ni-ida、m2 mab、streptavidin、gsh、amylose中的至少一种；

18、进一步地，步骤2中，所述磁性微球粒径为0.2～20μm。

19、采用上述技术方案后，本发明一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，具有以下有益效果：

20、本发明将st与sc分别与功能相关的不同酶进行融合表达，并且融合有亲和标签；通过亲和吸附将分别带有st与sc融合酶预先固定到亲和载体表面，由于酶分子在磁性微球表面的富集与分子间相互靠近，使得st与sc能够进行有效连接，从而形成磁性多酶复合体。这种亲和协同的共价连接可实现在固相载体表面进行多酶复合体的效率自组装。

21、(1)本发明采用亲和协助共价组装的方法在磁性微球表面自组装形成多酶复合体，利用亲和作用其重组蛋白被富集在磁性微球表面，并且重组蛋白之间相互靠近，可提高多酶复合体在界面上的组装效率。

22、(2)本发明提出的亲和协助共价组装形成的多酶复合体在空间上使得功能相关的酶相互靠近，缩短了催化过程中物质传递距离，提升传递效率，可使整体催化过程更加快速高效。

23、(3)本发明制备的磁性亲和载体可直接从粗蛋白中特异性捕获目标蛋白，并在载体表面自组装形成复合体，可节约繁琐的蛋白纯化的成本和避免潜在的酶活性损失的问题。

24、(4)本发明制备的磁固定化多酶复合体具有磁响应的特性，在外加磁场的作用下可进行快速分离，控制反应进程，并且所制备的磁性多酶复合体可重复利用，降低成本。

技术特征：

1.一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：步骤1中，通过基因工程方法将sc与st蛋白质基因序列与亲和标签序列分别引入功能相关的酶的基因末端，构建重组质粒，然后将重组质粒转化进入表达宿主菌中，再将含有重组质粒的细菌进行培养，蛋白质诱导表达，超声波细胞破碎，离心，得到含有重组蛋白的粗酶液。

3.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：步骤2中，将亲和配体通过化学方法结合到磁性微球表面。

4.如权利要求3所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：所述亲和标签包括his-tag、flag-tag、strep-tagⅱ、gst、mbp中的至少一种。

5.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：所述亲和标签与sc或st在重组蛋白中的相对位置包括同时位于n末端、同时位于c末端或亲和标签位于酶与sc或st之间。

6.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：步骤4中，将偶联有亲和配体的磁性微球与粗酶液混合的方式包括顺序加入或同时加入。

7.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：步骤1中，构建的重组蛋白中酶与sc或st之间的间隔臂为5～45个氨基酸，所述间隔臂氨基酸为甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的组合，或者所述间隔臂为谷氨酸(e)、丙氨酸(a)、甘氨酸(g)和脯氨酸(p)的组合。

8.如权利要求1所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：所述磁珠为磁性微球和/或磁性纳米颗粒。

9.如权利要求8所述的一种磁珠表面亲和协同共价组装构建多酶复合体的方法，其特征在于：所述磁性载体为磁性微球，磁性微球的粒径为0.2～20μm。

技术总结
本发明公开了一种在磁性微球表面进行亲和协助共价组装多酶复合体的方法，将SpyCatcher/SpyTag(SC/ST)分别与两种具有协同催化作用的酶融合表达，并且表达的两种融合蛋白均带有亲和标签，亲和标签与SpyCatcher/SpyTag在同一端，通过亲和标签的亲和作用将目标蛋白预吸附在功能化的磁珠表面，再经过SC/ST自发性共价连接作用在磁珠表面自组装形成酶复合体。该方法可直接从粗蛋白中捕获目标蛋白并自组装形成磁性多酶复合体。该磁性多酶复合体可用于涉及电子转移的多酶协同催化反应。本发明制备的亲和协助磁性多酶复合体具有催化效率高、分散性良好、磁响应速率快以及稳定性良好的特点，在生物传感器、手型物质生产、生物协同催化中具有极大应用价值。

技术研发人员：陈国,罗棉兴,池昌标
受保护的技术使用者：华侨大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17