一种新的人参皂苷单体及其制备方法

本发明涉及一种人参皂苷皂苷单体以及从人参或人参叶中提取分离得到这种新的人参皂苷皂苷单体化合物的制备方法，属于天然药物化学研究领域。

背景技术：

1、人参为五加科(araliaceae)人参属(panax)植物人参panax ginseng c.a.mey.的干燥根和根茎，具有大补元气，生津安神，复脉固脱，补脾益肺等功效。人参叶为五加科(araliaceae)人参属(panax)植物人参panax ginseng c.a.mey.的干燥叶，具有滋补、强壮、调节机能、提高机体免疫力以及抗炎等多种作用。现代研究表明，人参化学成分主要含有皂苷类、黄酮类、甾类、人参挥发油、有机酸类、人参多糖等多种类型化合物，其中人参皂苷是其最主要的活性成分，具有抗疲劳，活血化瘀，保护神经系统，抑制白血病细胞增殖，提高皮质激素水平，调节免疫功能，抗病毒，抗糖尿病等活性。人参皂苷主要分为达玛烷型，齐墩果酸型和奥克梯隆型，其中达玛烷型人参皂苷为四环三萜类化合物，分为原人参二醇型和原人参三醇型两种。目前已分离得到的人参皂苷，绝大多数都是达玛烷型及其衍生物。

2、至今为止文献报道的人参皂苷大约有100多种，其中20位连有三分子单糖同时3位连有两分子单糖的人参皂苷并不多见，主要有人参皂苷ra1、ra2、ra3和三七皂苷r4等。这四种化合物的结构式如下：

3、

4、

5、

6、ara(p):α-l-arabinopyranosyl；ara(f):α-l-arabinofuranosyl；glc:β-d-glucopyranoosyl；xyl:β-d-xylopyranosyl

7、张佳音等建立了人参属植物中人参皂苷ra1、ra2、ra3含量的hplc测定方法，通过体外实验考察了人参皂苷ra1、ra2、ra3对肺癌细胞(a549)、乳腺癌细胞(mcf-7)、肝癌细胞(hepg2)、黑色素瘤细胞(a375)的增殖抑制作用。实验结果表明，人参皂苷ra1、ra2、ra3对于肺癌细胞以及肝癌细胞有一定的增殖抑制作用(张佳音.人参中高极性人参皂苷类成分的研究[d].吉林大学,2017.)。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新的人参皂苷单体及其提取分离纯化方法，即3-o-[β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖基]-20-o-[β-d-吡喃木糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖基]-达玛-24-烯-3β,12β,20s-三醇(以下简称人参皂苷ra10)及其制备方法。

2、本文分得的新的人参皂苷其结构与人参皂苷ra3和r4类似，是它们的同分异构体。三者的区别在于20位木糖的连接方式不同，是至今为止尚未见到文献报道的新化合物。

3、本发明所述的新的人参皂苷单体即人参皂苷ra10的结构式如下。

4、

5、本发明还提供了人参皂苷ra10的制备方法，具体如下：

6、(1)取人参或人参叶粉碎，用乙醇溶液提取，提取液减压浓缩至无醇味后乙酸乙酯萃取，水层减压浓缩得人参或人参叶提取物；或者取人参或人参叶粉碎，加水或乙醇水溶液回流提取，水提液直接过大孔吸附树脂，醇提取液减压浓缩至无醇味后用水稀释后过大孔吸附树脂柱吸附，用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到人参或人参叶提取物；大孔吸附树脂洗脱液减压浓缩至无醇味后还可以用乙酸乙酯萃取，水层减压浓缩后得到人参提取物。

7、(2)将步骤(1)所得的提取物以体积比为甲醇:水＝1:1～纯甲醇的混合溶液为洗脱液进行ods柱层析梯度洗脱，tlc检验，合并含人参皂苷ra10的组分。

8、(3)将步骤(2)所得含人参皂苷ra10的组分减压回收溶剂，以体积比为乙酸乙酯:甲醇＝2:1～纯甲醇的混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，tlc检验，合并含人参皂苷ra10的组分。

9、(4)将步骤(3)所得含人参皂苷ra10的组分减压回收溶剂，再次以体积比为6:2:0.1～6:4:0.1的二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，tlc检验，合并含人参皂苷ra10的组分。

10、(5)将步骤(4)所得含人参皂苷ra10的组分减压回收溶剂，利用制备型高效液相色谱以乙腈-水(31:69)为流动相等度洗脱分离纯化，得到人参皂苷ra10。

11、本发明步骤(1)中乙醇水溶液的体积比为80％，人参或人参叶与乙醇水溶液的重量体积比为1：8-10，共提取两次，第一次提取回流2h，第二次提取回流1h。

12、本发明采用湿法装柱、干法上样，拌样时样品与固定相的重量比为1:2；ods柱层析样品与固定相的重量比为1：50，硅胶柱层析样品与固定相的重量比为1：60～1:80；制备型高效液相色谱检测器为紫外检测器，半制备色谱柱为酰胺柱。

13、本发明利用nmr等手段对人参皂苷ra10的化学结构进行了鉴定，鉴定过程及数据具体如下：

14、人参皂苷ra10为白色粉末。

15、13c-nmr谱(c5d5n,150mhz)中，共给出59个碳信号，结合dept 90°和dept 135°谱可知，人参皂苷ra10含有8个甲基信号(分别为：δc16.13,16.40,16.80,17.54,18.07,22.51,25.92,28.21)，14个亚甲基信号(分别为：δc18.56,23.32,26.74,26.90,30.83,30.93,35.25,36.32,39.34,62.94,63.10,67.55,70.36)，31个次甲基信号(分别为：49.63,50.32,51,72,56.51,70.25,70.84,71.29,71.71,71.83,71.88,74.99,75.39,76.09,77.20,77.86,77.94,78.07,78.39,78.48,78.53,78.80,79.41,83.15,84.62,89.02,98.21,103.31,104.89,105.51,106.55,126.10)，6个季碳信号(分别为：δc 37.03,39.85,40.16,51.51,83.57,131.17)。由13cnmr和dept谱图可知，δc131.17与δc126.10为烯碳信号，推测为24-烯，δc106.55,105.51,104.89,103.31,98.22为糖的端基碳信号。这些碳谱数据初步说明人参皂苷ra10是以原人参二醇为母核，分子内存在五分子单糖的人参皂苷类化合物。

16、在1h-nmr(c5d5n，600mhz)谱中，低场区出现5个糖的端基质子信号：δh4.798(1h,d,j＝7.8hz)、δh4.987(1h,d,j＝7.8hz)、δh5.003(1h,d,j＝7.8hz)、δh5.286(1h,d,j＝7.2hz)、δh5.382(1h,d,j＝7.8hz)，进一步确定分子中可能存在5个糖。由j值可知，这些糖均为β-d构型。结合文献，推测其中有4个是葡萄糖，另一个是木糖。低场中δh5.192(1h,s)推测为双键上的质子信号。

17、在hmbc谱中，δh1.533(c-21)与δc83.57存在远程相关，再结合hsqc谱可知δc83.57为母核c-20的碳信号。有一个葡萄糖的端基质子δh5.003(c-1”')与δc83.57有远程相关，可知人参皂苷ra10的母核20号碳上连有一分子葡萄糖。在hmbc谱中，另外有一个葡萄糖的端基质子δh4.987(c-1””)与δc70.36有远程相关，结合hsqc谱可知，δc70.36为连在母核20号碳上的葡萄糖的6号碳(c-6”')的碳信号，说明连在母核20号碳上的葡萄糖(内侧葡萄糖)的6号碳(c-6”')上连有一分子葡萄糖。在hmbc谱中，木糖的端基质子δh5.382(c-1””')与δc83.15有远程相关，在h-hcosy谱中，外侧葡萄糖端基质子δh4.987(c-1””)与δh3.973有相关，说明δh3.973为外侧葡萄糖的2号碳上的质子信号，再结合hsqc谱可知，外侧葡萄糖的2号碳(c-2””)的化学位移为δc83.15。综上分析，确定人参皂苷ra10的母核20号碳上连有2分子葡萄糖和1分子木糖，且它们的连接方式为木糖-(1→2)-葡萄糖-(1→6)-葡萄糖-。

18、同时在hmbc谱中，δh1.149(c-28)与δc89.02,56.51,39.85,16.80有远程相关，结合hsqc谱可知δc89.02,56.51,39.85,16.80这4个碳信号分别是c-3,c-5,c-4,c-29的碳信号，也就是说δc89.02为母核3号碳(c-3)的碳信号。有一个葡萄糖端基质子δh4.798(c-1')与δc89.02有远程相关，由此可知母核3号位c上连有一分子葡萄糖；另外有一个葡萄糖端基质子δh5.286(c-1”)与δc84.62有远程相关，结合hsqc谱可知，δc84.62是连在母核3号位c上葡萄糖的2号碳(c-2')的碳信号。因此，确定人参皂苷ra10的母核3号位c上连有两分子葡萄糖且其连接方式为葡萄糖-(1→2)-葡萄糖-。

19、综上分析，确定人参皂苷ra10为3-o-[β-d-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖基]-20-o-[β-d-吡喃木糖基-(1→2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1→6)-β-d-吡喃葡萄糖基]-达玛-24-烯-3β,12β,20s-三醇。文献检索结果表明人参皂苷ra10为未见报道的新化合物。人参皂苷ra10的主要hmbc与1h-1hcosy相关图如下：

20、

21、人参皂苷ra10的主要hmbc与1h-1hcosy相关图

22、人参皂苷ra10的13c-nmr(150mhz)和1h-nmr数据(600mhz)pyridine-d5

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24、

25、人参皂苷ra10纯度检测的hplc-uv色谱条件如下：

26、色谱柱：agilent zorbax sb-c18(4.6×250mm，5μm)

27、流动相：乙腈-0.2％磷酸水溶液(27.2：72.8)；流速：1ml/min；柱温：30℃；

28、进样量：20μl。