用于DNA提取前活体土壤线虫悬液的富集方法

本发明属于土壤线虫提取，具体涉及一种用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法。

背景技术：

1、土壤线虫是数量和种类最多的土壤动物，占据土壤食物网多个营养级，对环境响应敏感，是土壤健康的良好指示生物。不同营养级土壤线虫与土壤微生物、原生动物等通过取食与被取食的相互作用能够调控土壤食物网的结构动态，进而调节土壤的能量流动和养分循环。因此，开展土壤线虫的相关研究工作对保护土壤生物多样性、维持土壤生态功能有重要的意义。

2、土壤线虫的研究方法主要包括传统的形态学鉴定和分子生物学方法。由于线虫形态学鉴定需要更多的专业知识以及时间成本，分子生物学如高通量测序技术在土壤线虫多样性研究中的应用受到越来越多的关注。但高通量测序也存在一些亟待解决的问题，目前的研究表明富集线虫悬液后再提取线虫dna得到的线虫分类信息高于直接从土壤中提取线虫dna。但是如何富集线虫以及富集的线虫悬液的效果直接影响土壤线虫dna的提取效果。如，浅盘法在实际操作过程中得到的线虫悬液通常会根据土壤质地的不同得到所含杂质不一样的线虫悬液；而贝尔曼漏斗法由于直接将土壤置于网筛中提取，不仅耗时相对较长，而且会有部分土壤进入线虫悬液的可能。因此，两种方法收集的线虫悬液对于进一步提取线虫dna的效果都欠佳。

技术实现思路

1、因此，本发明提供一种用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法，能够解决现有技术中采用传统的浅盘法或者贝尔曼漏斗法获取线虫悬液，耗时长且线虫悬液内含有土壤等杂质较多，导致后续提取线虫dna效果不佳的技术问题。

2、为了解决上述问题，本发明提供一种用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法，包括如下步骤：

3、样品预处理步骤：称取目标质量的含有线虫的土壤样品，并将所述土壤样品置于第一烧杯内加水搅拌均匀，并在静置第一预设时间后将得到的上部水体过筛，获得含有线虫的泥浆，将所述泥浆用流动的水收集至第二烧杯内；

4、贝尔曼漏斗法分离线虫及去杂步骤：将所述第二烧杯内收集的水体转移至贝尔曼漏斗中进行线虫分离去杂，静置第二预设时间后得到富集有线虫的清洁悬液。

5、在一些实施方式中，在所述样品预处理步骤中，将得到的水体过筛采用如下方式：

6、将水体倒入双层网筛内，所述双层网筛包括上层网筛与下层网筛，所述上层网筛处于所述下层网筛之上，所述上层网筛的目数为60-80目，所述下层网筛的目数为400-500目，所述水体被倒入所述上层网筛，且水体在所述上层网筛过滤后进入所述下层网筛内实现对水体内线虫的收集，以获得处于所述下层网筛上的所述含有线虫的泥浆。

7、在一些实施方式中，

8、在所述水体倒入所述双层网筛内时，在水体过筛过程中，振动所述双层网筛；和/或，所述样品预处理步骤重复3次。

9、在一些实施方式中，

10、振动所述双层网筛时所产生的振幅为1-2mm。

11、在一些实施方式中，

12、所述目标质量为50-200g，所述第一烧杯的容量为2000ml，向所述第一烧杯内加水1000-1500ml，所述第二烧杯的容量为250-300ml；和/或，在所述样品预处理步骤中，将所述泥浆收集至所述第二烧杯内，每次所用流动的水的水量为80-100ml。

13、在一些实施方式中，

14、所述贝尔曼漏斗法分离线虫及去杂步骤具体包括：

15、在贝尔曼漏斗中放置18-20目的支撑网筛并在网筛上平铺上层线虫面巾纸，在所述贝尔曼漏斗内铺设下层线虫面巾纸，将所述第二烧杯内收集的水体倒入所述上层线虫面巾纸上，并保证贝尔曼漏斗内水体水位浸没所述上层线虫面巾纸。

16、在一些实施方式中，

17、在将所述第二烧杯内收集的水体倒入所述上层线虫面巾纸上之前，在上层线虫面巾纸上放置表面皿，之后将所述第二烧杯内收集的水体经由玻璃棒及所述表面皿引流至所述支撑网筛内。

18、在一些实施方式中，

19、所述贝尔曼漏斗的容积为150-350ml、口径为10-12cm，且所述支撑网筛处于所述贝尔曼漏斗的上口以下2cm。

20、在一些实施方式中，

21、所述第一预设时间为30s-60s，所述第二预设时间为24h-36h。

22、在一些实施方式中，用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法还包括：

23、在静置第二预设时间后得到富集有线虫的清洁悬液时，用试管收集10-15ml的线虫悬液。

24、本发明提供的一种用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法，具有以下有益效果：

25、在进行贝尔曼漏斗法分离线虫及去杂步骤之前，先将土壤样品充分混匀在第一烧杯内然后进行过筛获得含有线虫的泥浆，能够有效降低所获得的线虫悬液中的杂质含量，避免直接采用贝尔曼漏斗法分离线虫的传统方式存在土壤样品内的杂质对相应的面巾纸的破坏所导致的线虫悬液杂质含量过多所导致的提取线虫dna效果不佳的不足，同时，由于增加了样品预处理步骤，通过在第一烧杯内搅拌混匀并过筛能够极大程度地降低分离线虫的耗时，进而提升线虫悬液的富集效率。

技术特征：

1.一种用于dna提取前活体土壤线虫悬液的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，在所述样品预处理步骤中，将得到的水体过筛采用如下方式：

3.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的富集方法，其特征在于，

5.根据权利要求2所述的富集方法，其特征在于，

6.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述贝尔曼漏斗法分离线虫及去杂步骤具体包括：

7.根据权利要求6所述的富集方法，其特征在于，

8.根据权利要求6所述的富集方法，其特征在于，

9.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，

10.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，还包括：

技术总结
本发明提供一种用于DNA提取前活体土壤线虫悬液的富集方法，包括如下步骤：样品预处理步骤：称取目标质量的含有线虫的土壤样品，并将所述土壤样品置于第一烧杯内加水搅拌均匀，并在静置第一预设时间后将得到的上部水体过筛，获得含有线虫的泥浆，将所述泥浆用流动的水收集至第二烧杯内；贝尔曼漏斗法分离线虫及去杂步骤：将所述第二烧杯内收集的水体转移至贝尔曼漏斗中进行线虫分离去杂，静置第二预设时间后得到富集有线虫的清洁悬液。本发明能够有效降低所获得的线虫悬液中的杂质含量，同时，由于增加了样品预处理步骤，通过在第一烧杯内搅拌混匀并过筛能够极大程度地降低分离线虫的耗时，进而提升线虫悬液的富集效率。

技术研发人员：杜晓芳,李琪,李英滨,姜思维
受保护的技术使用者：中国科学院沈阳应用生态研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19