固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法与流程

本发明涉及酶的固定，尤其涉及一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备upu型甘油酯的方法。

背景技术：

1、upu型结构甘油酯( u不饱和脂肪酸， p饱和脂肪酸)因其独特的结构，在婴幼儿生长发育时期，起到为婴幼儿提供能量、促进脂肪酸吸收、改善便秘，防止矿物质钙流失等作用。鉴于乳脂中甘油三酯的独特组成和功效，目前中国市场上的婴幼儿配方乳脂在整体脂肪酸组成和含量上能够很好地模拟中国母乳的特点，但在甘油骨架的sn-1和sn-3位脂肪酸的种类和含量方面存在显著差异，亟待开展婴幼儿配方乳脂upu绿色合成工艺理论与产业化研究。

2、母乳中含量较高的upu主要是1，3－二油酸－ 2－棕榈酸甘油三酯(1，3－olein－2－palmitin triacylglycerols，opo)、1－油酸－2－棕榈酸－3－亚油酸甘油三酯(1－olein－2－palmitin－3－linolein triacylglycerols，opl)、1，3－二亚油酸－2－棕榈酸甘油三酯(1，3－linolein－2－palmitin triacylglycerols，lpl)，其他微量的upu还包括oppo (18∶1－16∶0－16∶1)、lppo(18∶2－16∶0－16∶1)、opdha(18∶1－16∶0－22∶6)、lpdha(18∶2－16∶0－ 22∶6)等［7－8 ］ 。其中，opo是欧美国家母乳中含量高的甘油三酯，而中国母乳中含量最高的是opl。临床试验表明，喂食母乳和含猪油的奶粉的婴儿，比喂食配方奶粉的婴儿表现出更高的脂肪、钙的吸收和更低的粪便硬度.对婴幼儿脂肪吸收、粪便硬度有益的是一类upu的综合作用，包括opl、lpl及其他微量upu。2019年《国产婴幼儿配方乳粉提升行动方案》明确指出明要大力实施国产婴幼儿配方乳粉“品质提升、产业升级、品牌培育”。因此，为了满足国产婴幼儿配方奶粉所需，提升国民整体健康水平，upu绿色合成工艺和产业化研究势在必行。

3、upu型甘油酯合成方法一般可以分为酯化法、酸解法、转酯法等。近年来由于酶法制备功能性油脂的反应条件温和、催化效率高、环保等优点引起了广泛关注。目前国内外酶法制备富含 upu结构脂的工艺主要以棕榈硬脂为原料，然后通过脂肪酶催化与油酸，亚油酸等不饱和脂肪酸酯化反应合成较高纯度upu，但因酶制剂要选择针对性比较强的酶制剂，比例公开专利文献：cn112314709一种酶法合成中国母乳甘油三酯替代品的制备方法及用途，需要添加定向的脂肪酶，定向的脂肪酶价格贵，而且该专利文献中定向的脂肪酶没有被固定化，反应不能更充分且酶不能被重复利用；cn 111647593 a 专利文献公开了生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成opo中的应用，将脂肪酶利用生物矿化的方式固定，再分散在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化钙溶液，得到固定化脂肪酶；虽然可以改善脂肪酶的热稳定性和催化活性，但是生物矿化方法复杂，需要的纳米复合材料昂贵。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备upu型甘油酯的方法，固定化脂肪酶方法简单、upu型甘油酯得率高。

2、为实现上述目的，本发明所提供的一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备upu型甘油酯的方法采用如下技术方案：

3、一种固定化脂肪酶的制备方法， 包括步骤：在去离子水中平衡聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于脂肪酶的pi值1.5~2.5；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得固定化脂肪酶。

4、可选的，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于所述脂肪酶的pi值是：用ph滴定仪、4~6%hcl的2bv缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值。

5、可选的，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于所述脂肪酶的pi值前，对所述聚丙烯酸树脂颗粒进行预处理：将所述聚丙烯酸树脂颗粒用95wt%乙醇浸泡4-12 h，冲洗无乙醇气味后，用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h后水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。

6、可选的，所述将所述平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，所述平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8~1:4。

7、可选的，所述磷酸盐缓冲溶液的ph值是5~9。

8、可选的，所述在20~40℃下搅拌反应0.5~3h中所述搅拌转速是70 - 80 rpm。

9、可选的，所述将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡中，所述脂肪酶与所述磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1:10-1:20。

10、一种使用固定化脂肪酶制备upu型甘油酯的方法， 将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸和所述固定化脂肪酶混合均匀，在55~65℃下搅拌，反应3-5h，得到upu型油脂；所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8-1:15，所述固定化脂肪酶的添加量是所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%-10%。

11、可选的，所述反应3-5h后，采用分子蒸馏脱脂肪酸得到upu型油脂；所述分子蒸馏的条件是：冷凝水温度30°c，夹套温度60°c，分子蒸馏温度为200°c，进料速率为3 ml/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 mpa。

12、本发明使用聚丙烯酸树脂固定脂肪酶，相对于现有技术中使用生物矿化的方法固定脂肪酶，本发明原料简单易获得，固定方法简单易行；相对于使用定向酶制备upu型甘油酯，本发明脂肪酶价格便宜。本发明固定化脂肪酶与现有诺维信脂肪酶novozym 435对比，傅里叶变换红外谱图显示本发明固定化脂肪酶上物质与诺维信脂肪酶novozym 435相当，对比树脂比表面积也相当，sem扫描电镜显示脂肪酶均匀附着在树脂上，本发明固定化脂肪酶符合国家标准，但是本发明固定化脂肪酶成本却远远低于诺维信脂肪酶novozym 435。在制备upu型甘油酯时，本发明固定化脂肪酶制备的upu型甘油酯opo含量略高，但是本发明固定化脂肪酶成本却远远低于诺维信脂肪酶novozym 435。

技术特征：

1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：在去离子水中平衡聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于脂肪酶的pi值1.5~2.5；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得固定化脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于所述脂肪酶的pi值是：用ph滴定仪、4~6%hcl的2bv缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值。

3.根据权利要求2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的ph值高于所述脂肪酶的pi值前，对所述聚丙烯酸树脂颗粒进行预处理：将所述聚丙烯酸树脂颗粒用95wt%乙醇浸泡4-12 h，冲洗无乙醇气味后，用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h后水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。

4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述将所述平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，所述平衡ph后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8~1:4。

5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的ph值是5~9。

6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在20~40℃下搅拌反应0.5~3h中所述搅拌转速是70 - 80 rpm。

7.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡中，所述脂肪酶与所述磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1:10-1:20。

8.一种使用权利要求1-7任一项所述固定化脂肪酶制备upu型甘油酯的方法，其特征在于，将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸和所述固定化脂肪酶混合均匀，在55~65℃下搅拌，反应3-5h，得到upu型油脂；所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8-1:15，所述固定化脂肪酶的添加量是所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%-10%。

9.根据权利要求8所述的使用固定化脂肪酶制备upu型甘油酯的方法，其特征在于，所述反应3-5h后，采用分子蒸馏脱脂肪酸得到upu型油脂；所述分子蒸馏的条件是：冷凝水温度30°c，夹套温度60°c，分子蒸馏温度为200°c，进料速率为3 ml/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 mpa。

技术总结
本发明涉及酶的固定技术领域，尤其涉及一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法。固定化脂肪酶的制备方法，包括步骤：在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于所述脂肪酶的pI值；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒和脂肪酶上清液分散在磷酸盐缓冲溶液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得所述固定化脂肪酶。本发明提供的固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法，固定化脂肪酶方法简单、UPU型甘油酯得率高。

技术研发人员：曹庸,曾志安,李一峰,阚启鑫,刘果,陈丽梅,戴伟杰
受保护的技术使用者：广东惠尔泰生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15