本发明涉及基因编辑,特别涉及一种cas12a变体hyperfi-as及其在基因编辑中的应用。
背景技术:
1、自2013年以来,基因编辑技术取得了突破性进展,此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的cas9系统之外,cas12,又名cpf1,作为又一种被发现的具有基因编辑效应的crispr系统新成员,极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围,相比于cas9系统,cas12a所具有的加工前提rna的功能,为其介导多基因编辑提供了相比与cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外,相比于cas9的向导rna,cas12a的向导rna组成更为简单,设计更为方便。
2、2015年,张峰团队首次发现了cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员,cas12a,又名cpf1,将其划分到crispr系统2类v型中。相比于cas9系统,cas12a的编辑效率与cas9的效率相当,在有些靶点低于cas9。cas12a的脱靶率极低,相比于cas9脱靶率高的特性,cas12a是一种安全的基因编辑工具。cas12a在切割之后形成粘性末端,而cas9形成平末端,已有研究表明,cas12a切割之后的粘性末端相比于cas9的平末端而言,更容易发生同源重组修复,这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导rna的加工方面,cas12a具有明显的优势,仅仅只需要cas12a本身就能够完成对前提rna的加工,而cas9系统则需要rnaseiii的加工,这极大地促进cas12a在多基因编辑上的应用。在pam的识别上,cas12a识别5’-tttn-3’或5’-kytv-3’,cas9则识别5’-ngg-3’。
3、因此,cas12a作为一种新型基因编辑工具,与cas9系统一道,为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的cas12a的研究,为应对将来各种情况下的基因编辑事件,发现更多的具有一定特性的cas12a变体是一件具有重要意义的事情。
技术实现思路
1、本发明目的是提供一种cas12a变体hyperfi-as及其在基因编辑中的应用,该cas12a变体hyperfi-as为ii类v型crispr蛋白,与现有的相较于ascas12a其他变体以及cas9(变体)相比,在全基因组上脱靶效应更低。
2、为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
3、在本发明的第一方面,提供了一种cas12a变体hyperfi-as,所述cas12a变体hyperfi-as为ii类v型crispr蛋白,氨基酸序列如sed id no.1所示。
4、在本发明的第二方面,提供了一种重组表达载体,所述重组载体表达所述的cas12a变体hyperfi-as。
5、进一步地,所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的一种。
6、在本发明的第三方面,提供了一种重组菌或重组细胞系或重组病毒,包含所述的重组表达载体。
7、在本发明的第四方面,提供了一种重组病毒,所述重组病毒采用所述的病毒载体包装获得,所述重组病毒包括表达所述的cas12a变体hyperfi-as的腺病毒或慢病毒。
8、在本发明的第五方面,提供了一种包括所述cas12a变体hyperfi-as的crispr/cas12a基因编辑系统。
9、在本发明的第六方面,提供了所述系统还包括:靶向目标基因的crrna或crdna。
10、在本发明的第七方面,提供了一种所述的cas12a变体hyperfi-as、所述的重组表达载体、所述的重组菌或重组细胞系、所述的重组病毒、所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用。
11、在本发明的第八方面,提供了一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法,借助crispr/cas12a系统对受体中的目的基因进行基因编辑,所述方法包括:
12、通过将所述的重组表达载体导入受体提供cas12a变体hyperfi-as;
13、通过靶向目标基因的crrna或crdna质粒导入受体提供crrna;
14、所述cas12a变体hyperfi-as和所述crrna在受体中形成复合物识别目的基因并完成编辑。
15、进一步地,所述受体包括293t细胞、atdc5细胞和c6细胞中的一种。
16、本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
17、本发明提供的一种cas12a变体hyperfi-as及其在基因编辑中的应用,本发明首次通过蛋白改造,获得全基因组内脱靶效应更低的cas12a变体hyperfi-as,该变体在体内相较于对应野生型具有较低的脱靶效率,为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具,对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。
1.一种cas12a变体hyperfi-as,其特征在于,所述cas12a变体hyperfi-as为ii类v型crispr蛋白,氨基酸序列如sed id no.1所示。
2.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体表达权利要求1所述的cas12a变体hyperfi-as。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的一种。
4.一种重组菌或重组细胞系或重组病毒,其特征在于,包含权利要求2所述的重组表达载体。
5.一种重组病毒,其特征在于,所述重组病毒采用权利要求3所述的病毒载体包装获得,所述重组病毒包括表达权利要求1所述的cas12a变体hyperfi-as的腺病毒或慢病毒。
6.一种包括权利要求1所述cas12a变体hyperfi-as的crispr/cas12a基因编辑系统。
7.根据权利要求6所述的crispr/cas基因编辑系统,其特征在于,所述系统还包括:靶向目标基因的crrna或crdna。
8.一种权利要求1所述的cas12a变体hyperfi-as、或权利要求2-3任一所述的重组表达载体、或权利要求4所述的重组菌或重组细胞系、或权利要求5所述的重组病毒、或权利要求6-7任一所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用。
9.一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法,其特征在于,借助crispr/cas12a系统对受体中的目的基因进行基因编辑,所述方法包括:
10.根据权利要求9所述的一种对受体中的目的基因进行基因编辑的方法,其特征在于,所述受体包括293t细胞、atdc5细胞和c6细胞中的一种。