一种高产细胞株的单克隆筛选方法与流程

本发明涉及高产工程细胞株筛选，具体为一种高产细胞株的单克隆筛选方法。

背景技术：

1、构建稳定高产的工程细胞株是生物制药至关重要的一环，通常工程细胞株的构建流程为转染→细胞pool筛选→单克隆筛选→细胞株稳定性评估→工艺优化。在单克隆筛选环节，由于单个细胞生长困难，单克隆铺板培养基也是各企业研究、优化的重点。即使有合适的单克隆铺板培养基，1块96孔板的单克隆获得率也是很低的(通常30％)，这其中还包括很多低产或中产的细胞。为了从单克隆中筛选出稳定、高产的单克隆株，往往需要铺大量的96孔板，然后进行高通量的筛选才能选中理想的细胞。96孔板的细胞一般在大部分细胞生长至汇合度＞15％时检测上清表达量，根据96孔板单克隆的定量结果，有的企业会选出100～400株用深孔板的方式进行高通量筛选，有的企业因设备受限等原因只能选择20～30株进行筛选，目前所用的这些筛选方法存在的问题和缺点如下：

2、1、因低产细胞生长往往比高产细胞生长快，在检测上清表达量时高产细胞生长不具优势，容易导致漏筛选；

3、2、根据定量结果选出100～400株进行进一步高通量筛选，工作量大、设备需求高，检测量大且需要检测部门的支持；

4、3、根据定量结果选出20～30株进行进一步筛选，必须保证这20～30株中就已经筛选到了高表达细胞，而96孔板中细胞上清的检测值不能完全代表此细胞在后续发酵的真实表达量，所以很容易漏选高表达细胞。

5、因此，为解决上述技术问题，本发明涉及一种通量小、设备要求低、检测量小、不易漏选高产细胞株的单克隆筛选方法。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种高产细胞株的单克隆筛选方法，以解决上述背景技术中的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高产细胞株的单克隆筛选方法，包括以下步骤：

3、s1，铺单克隆前一天传代细胞；

4、s2，细胞培养24小时计数，确认细胞处于对数生长期；

5、s3，用单克隆培养基将细胞稀释，混匀后用排枪吸细胞液至96孔板；

6、s4，静置2～3小时后，用成像系统成像即d0成像记录；

7、s5，d1、d2用成像系统成像，d3之后可间隔一定时间成像；

8、s6，d7～d10补培养基200μl/孔

9、s7，d10之后根据成像记录追溯是否为单克隆；

10、s8，第一批检验：

11、培养13天后成像关注单克隆的汇合度，当大部分单克隆汇合度≥10％时，可安排第二天取上清定量，汇合度＜10％的单克隆暂不检测继续培养；

12、s9，挑选的单克隆进行放大培养：

13、定量当天将待检验细胞液吹打均匀后用成像系统成像，取上清定量，根据定量结果和细胞当天及前一天汇合度综合来挑选最佳单克隆，比如在表达量相当的单克隆中挑选汇合度低的单克隆，或者在汇合度相当的单克隆中挑选表达量高的单克隆，挑选的单克隆进行放大培养；

14、s10，第二批检验：

15、汇合度＜10％的单克隆继续培养几天，待大部分单克隆汇合度≥10％时，安排第二天取上清定量，方法同s9；

16、s11，挑选的所有单克隆放大培养后进行fed-batch培养，评估最终表达量及质量。

17、优选的，所述s1具体步骤为铺单克隆前一天按3e5cells/ml传代细胞。

18、优选的，所述s3中细胞稀释浓度为8～10cells/ml。

19、优选的，所述d0为1个细胞。

20、优选的，所述s3中混匀后用排枪吸细胞液至96孔板，100μl/孔。

21、本发明至少具备以下有益效果：

22、(1)本发明提供的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，在筛选单克隆时不只依据96孔板的细胞表达量，同时兼顾细胞生长状态，综合多因素筛选细胞，且分阶段来筛选，不容易漏筛选高产细胞株；

23、(2)本发明提供的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，大大的减少了工作量、对设备的需求低，检测量小的同时更高几率筛选到高产细胞株。

技术特征：

1.一种高产细胞株的单克隆筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，其特征在于：所述s1具体步骤为铺单克隆前一天按3e5cells/ml传代细胞。

3.根据权利要求1所述的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，其特征在于：所述s3中细胞稀释浓度为8～10cells/ml。

4.根据权利要求1所述的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，其特征在于：所述d0为1个细胞。

5.根据权利要求1所述的一种高产细胞株的单克隆筛选方法，其特征在于：所述s3中混匀后用排枪吸细胞液至96孔板，100μl/孔。

技术总结
本发明提供了一种高产细胞株的单克隆筛选方法，包括以下步骤：S1，铺单克隆前一天传代细胞；S2，细胞培养24小时计数，确认细胞处于对数生长期；S3，用单克隆培养基将细胞稀释，混匀后用排枪吸细胞液至96孔板；S4，静置2～3小时后，用成像系统成像即D0成像记录；S5，D1、D2用成像系统成像，D3之后可间隔一定时间成像；S6，D7～D10补培养基200μl/孔S7，D10之后根据成像记录追溯是否为单克隆；S8，第一批检验；S9，挑选的单克隆进行放大培养；S10，第二批检验；S11，挑选的所有单克隆放大培养后进行Fed‑batch培养，评估最终表达量及质量。本方案综合多因素筛选细胞，且分阶段来筛选，不容易漏筛选高产细胞株。

技术研发人员：孙利燕,周婷婷,程振北,狄春辉
受保护的技术使用者：北京力邦生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29