一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法

本发明涉及生物，具体涉及一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法。

背景技术：

1、蚯蚓营腐生生活，常年生活在含有大量微生物的土壤中，但是蚯蚓却极少生病，这与蚯蚓的以体液免疫为主的免疫系统有关，而在蚯蚓的体液免疫中，各类抗菌肽和抗菌蛋白发挥着重要的作用。外界刺激如机械损伤、重金属污染物能够促进蚯蚓合成抗菌肽和抗菌蛋白。因此，本发明采用茶枯液刺激蚯蚓，促进其大量表达抗菌活性物质，再通过匀浆、冻干即可得到蚯蚓抗菌粗蛋白。蚯蚓抗菌粗蛋白可用于畜牧养殖的添加剂，也可用于用于医疗卫生保健等方面。

2、公开号为cn102406052a的中国专利提供了一种蚯蚓抗菌肽水解也及含有该抗菌肽水解液的饲料，但是该专利中抗菌肽水解液的制备方法仅为将蚯蚓、红糖、水、防腐剂等混合匀浆、加热水解所得，并未使用外源刺激促使蚯蚓过量表达蚯蚓抗菌肽，这可能使得制得产物抗菌活性较低，不能显著抑制部分病原微生物，同时该专利也并未公开其产物对微生物的抑制作用。公开号为cn113101305a的中国专利提供了一种发酵蚯蚓粉及其制备方法，其产物具有抗菌活性，但是其制备过程需要加热、发酵和干燥，流程较长且所需成本较高。公开号为cn116173192a的中国专利提供了一种生物抑菌制剂及其应用，但是在该专利中需要对蚯蚓匀浆产物进行提纯，并混入核酸酶激活剂和溶菌酶，成本较高，且纯化过程需要进行离子交换层析和亲和层析，技术要求较高。本发明中采用茶枯液刺激蚯蚓，促使蚯蚓大量表达抗菌活性物质，匀浆、冻干即可得到蚯蚓抗菌粗蛋白，所需步骤简单易行，成本较低，且抗菌效果良好，更容易推广使用。

3、现有的研究论文(孙振钧.应激蚯蚓诱导抗菌肽作为环境风险评价生化标记的研究(英文).莱阳农学院学报,2001(04):325-334)中，公开了在大肠杆菌注射、机械损伤和重金属处理这3种应激处理中，蚯蚓对大肠杆菌的注射敏感性高。但是，大肠杆菌注射会导致所得的抗菌肽中残留有部分大肠杆菌细胞壁所含的内毒素，因而直接使用此类抗菌肽存在一定的风险。如果利用去除手段将内毒素除去，则成本过高，这使得该先行研究所得的大肠杆菌注射蚯蚓提取抗菌肽的方法受限。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、蚯蚓洗净，上覆滤纸，加入茶枯液，静置；

5、s2、将步骤s1得到的蚯蚓洗净，加入tris溶液，匀浆，离心，得到上清液；

6、s3、在上清液中加入乙酸溶液，低温静置，冷冻干燥，得到蚯蚓抗菌粗蛋白。

7、优选地，步骤s1中所述滤纸的层数为3-4层。

8、优选地，步骤s1中所述茶枯液包括茶枯、nahco3。

9、优选地，所述茶枯液中茶枯的浓度为0.3-0.5g/ml。

10、优选地，所述茶枯液的加入量为4-6ml。

11、优选地，步骤s1中所述蚯蚓包括栉盲远盲蚓、梯形流蚓、日本杜拉蚓、湖北远盲蚓、威廉腔蚓中的至少一种。

12、优选地，步骤s1中所述静置的时间为15-30min。

13、优选地，步骤s2中所述tris溶液的浓度为0.02-0.04mol/l。

14、优选地，步骤s3中所述乙酸溶液的浓度为0.1-0.2mol/l。

15、优选地，步骤s3中所述低温静置的时间为2-4h，温度为4-6℃。

16、优选地，步骤s3中所述冷冻干燥后还包括无菌水复溶。

17、本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的蚯蚓抗菌粗蛋白。

18、蚯蚓在含有大量微生物的土壤环境中生存，体内含有大量的抗菌活性物质，并且蚯蚓营养价值高，因此蚯蚓广泛地应用于动物饲料等领域。但是在未受到刺激的情况下，蚯蚓体内抗菌活性物质的表达量较低，直接利用未受刺激的蚯蚓制备抗菌肽或其他抗菌活性物质得到的产量较低，这将增加制备的流程和成本。本发明在此基础上，利用蚯蚓受到外源刺激后大量表达抗菌活性物质这一特性，通过筛选合适的茶枯液刺激蚯蚓，优化茶枯液的浓度和刺激时间，最终制成蚯蚓抗菌粗蛋白。本发明所制成的蚯蚓抗菌粗蛋白既可作为添加剂加入牲畜饲料中，有效改善牲畜肠道菌群，促进牲畜食欲，提升牲畜免疫力，又可作为医疗卫生用品，抑制环境中致病微生物的生长。

19、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

20、(1)与现有技术相比，本发明相对于抗菌肽分离纯化工艺或基因工程表达纯化工艺大大降低了生产成本；

21、(2)相对于普通的将蚯蚓直接制备成具有抗菌效果产品的工艺，本发明采用了油茶籽榨油后所产生的茶枯对蚯蚓进行刺激，促进蚯蚓表达抗菌肽等抗菌活性物质，使得最终得到的抗菌粗蛋白具有较好的抗菌活性，能够抑制铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌和粘质沙雷氏菌的生长；

22、(3)本发明的蚯蚓抗菌粗蛋白能添加入饲料中用于牲畜养殖，不但能调节牲畜肠道微生物，提高牲畜免疫力和食欲，还能为牲畜提供多种氨基酸，促进牲畜生长；

23、(4)本发明所述的抗菌粗蛋白也可用于与医疗卫生中的环境消毒，本发明所述蚯蚓抗菌粗蛋白安全无残留，且具有良好的广谱抗菌活性，应用潜力优秀；

24、(5)本发明中采用茶枯液刺激蚯蚓，刺激过后将蚯蚓洗净，去除了茶枯液残留，同时茶枯为天然产物，仅对蚯蚓有一定的刺激作用，其废液无需特殊处理，安全环保，有利于大规模使用；

25、(6)本发明的制备方法中冷冻干燥步骤能够去除乙酸，避免影响抗菌粗蛋白在后续作为饲料添加剂的应用。

技术特征：

1.一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述滤纸的层数为3-4层。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述茶枯液包括茶枯、nahco3。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述蚯蚓包括栉盲远盲蚓、梯形流蚓、日本杜拉蚓、湖北远盲蚓、威廉腔蚓中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述静置的时间为15-30min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述tris溶液的浓度为0.02-0.04mol/l。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述乙酸溶液的浓度为0.1-0.2mol/l。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述低温静置的时间为2-4h，温度为4-6℃。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述冷冻干燥后还包括无菌水复溶。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的蚯蚓抗菌粗蛋白。

技术总结
本发明提供了一种蚯蚓抗菌粗蛋白的制备方法，属生物技术领域。技术方案包括：用茶枯液对蚯蚓进行刺激，再将蚯蚓匀浆，离心分离，冻干后得到蚯蚓抗菌粗蛋白。本发明可以采用的蚯蚓物种包括栉盲远盲蚓、梯形流蚓、日本杜拉蚓、湖北远盲蚓或威廉腔蚓。所得蚯蚓抗菌粗蛋白溶于无菌水后可以抑制铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌和粘质沙雷氏菌。本发明具有原料来源广泛，制取方法简单等优点，具有应用于畜牧养殖、医疗卫生等方面的潜在价值。

技术研发人员：李银生,吴宜钊,赵琦,蒋际宝,张一帆
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29