用于细胞膜成像的磷光探针及其制备方法和应用

本发明属于分子探针，本发明涉及用于细胞膜成像的磷光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞膜是保护细胞内众多细胞器免受周围环境影响的重要屏障，在细胞信号转导和生物分子转运中发挥着重要作用，并且与许多生理和病理过程息息相关。监测和分析细胞膜的动态行为有助于揭示细胞活动、信号转导通路等关键过程，对于药物筛选、疾病早期诊断和治疗、以及信号转导控制等多个应用领域至关重要。

2、目前，基于荧光探针标记细胞膜的方法应用广泛，该方法可实时监测活细胞内细胞膜的动态变化，是原位可视化细胞膜的一种重要途径，为分析细胞膜功能提供关键信息。

3、以有机基团为荧光发光体的细胞膜探针虽然具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、发射波长可调等优势，但其stokes位移小，易受激发光干扰；发光寿命较短，易受活体中短寿命强背景荧光干扰，影响分析检测和成像的准确性。

4、除了选择发光基团，有效的靶向单元也是开发细胞膜荧光探针的关键步骤之一。设计膜靶向单元主要考虑细胞膜的两个关键成分，即细胞膜膜蛋白和磷脂双分子层。细胞膜蛋白标记方法主要基于融合蛋白标记、抗体、小分子配体和适配体。但该方法的探针设计复杂且原料费用昂贵。以磷脂双分子层作为目标单元的细胞膜靶向探针以烷基链、胆固醇和生育酚作为细胞膜靶向基团。选择烷基链和生育酚作为细胞膜靶向基团时，两者很容易内化到细胞中，在细胞膜上的停留时间较短，不利于长期监测细胞膜的动态变化。

5、现有的标记细胞膜的荧光探针，存在分析检测和成像的准确性较差、细胞膜标记速度较慢和抗渗透性差，即容易内化进入细胞靶向其他细胞器等问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一类用于细胞膜成像的磷光探针及其制备方法和应用。该探针的母体磷光团为ru(ii)或铱(iii)配合物，具有stokes位移较大、发光寿命长、光学和热力学性质稳定等优势。选择胆固醇作为细胞膜靶向基团，胆固醇的刚性结构有利于长期标记在细胞膜上，探针可在细胞膜上保持120分钟不内化。此外，该探针的细胞膜靶向速度快，仅需5分钟的孵育时间即可实现细胞膜成像效果，同时具有良好的抗渗透性，优于现有的细胞膜商用染料。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明的第一个目的是提供一类用于细胞膜成像的磷光探针，所述细胞膜成像的磷光探针为以钌或铱为中心离子的配合物m-chol，m为ru或ir；其分子结构通式如下所示：

4、

5、本发明的第二个目的是提供一种上述用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，包括如下步骤：

6、s1.以4,4-二甲基-2,2-联吡啶作为反应物，二氧化硒为催化剂，1,4-二氧六环作为溶剂，在氩气保护条件下回流搅拌24h，经过滤，柱层析纯化得式1化合物。

7、s2.s1所得式1和硝酸银作为反应物，氢氧化钠作为碱，乙醇和去离子水作为溶剂，室温反应24h，经过滤，调节溶液ph得式2化合物。

8、s3.s2所得式2和氯化亚砜作为反应物，在氩气保护条件下回流搅拌3h，减压蒸馏后得式3化合物，然后以式3和胆固醇作为反应物，无水三乙胺作为碱，无水二氯甲烷作为溶剂，在室温条件下反应24h，经柱层析纯化得式4化合物。

9、s4.以三氯化钌、联吡啶作为反应物，n,n-二甲基甲酰胺作为溶剂，在氩气保护条件下回流搅拌8h，冷却至室温加丙酮搅拌30min后，在0℃过夜，经过滤洗涤后得式5化合物；

10、s5.以三氯化铱、苯基吡啶作为反应物，乙二醇和水作为溶剂，在氩气保护条件下回流搅拌24h，经过滤后得式6化合物；

11、s6.以式4和式5、式4和式6为反应物，在氩气保护条件下回流反应，经柱层析纯化得磷光探针m-chol，m为ru或ir；

12、其反应式如下：

13、

14、进一步的，步骤s1中，所述4,4-二甲基-2,2-联吡啶、二氧化硒的物质的量摩尔比为1:1.6。

15、进一步的，步骤s1中，回流温度为106℃。

16、进一步的，步骤s2中，所述式1、硝酸银、氢氧化钠的物质的量摩尔比为1:1:3.75。

17、进一步的，步骤s2中，所述乙醇、去离子水的体积比为1.6:1。

18、进一步的，步骤s2中，用盐酸调节ph；所述盐酸的浓度为6mol/l。

19、进一步的，步骤s3中，所述式3、胆固醇、三乙胺的物质的量摩尔比为1:1:3。

20、进一步的，步骤s3中，回流温度为80℃。

21、进一步的，步骤s4中，所述三氯化钌、联吡啶的物质的量摩尔比为1:2。

22、进一步的，步骤s5中，所述三氯化铱、苯基吡啶的物质的量摩尔比为1:2。

23、进一步的，步骤s5中，所述乙二醇、去离子水的体积比为3:1。

24、进一步的，步骤s6中，所述式4、式5的物质的量摩尔比为1:1；所述式4、式6的物质的量摩尔比为1:2。

25、本发明的第三目的是提供一种上述合成方法制备的用于细胞膜成像的磷光探针在标记细胞膜中的应用，该探针在细胞膜成像实验中具有高磷光强度，细胞膜靶向速度快，仅需5分钟的孵育时间即可达到细胞膜成像效果。此外，探针还表现出良好的抗渗透性，能够在细胞膜上保持120分钟而不发生内化，相较于当前市售的细胞膜染料，呈现更为卓越的性能。

26、本发明以钌或铱为中心离子的过渡金属配合物为发光团，胆固醇为细胞膜靶向基团，具有长寿命、双光子激发和良好的细胞膜靶向优势，可以弥补现有的细胞膜靶向荧光探针的不足，成为研究细胞膜形态和动态变化的有力工具。

27、本发明与现有技术相比的有益效果是：

28、(1)相比与传统的有机荧光探针，ru(ii)、铱(iii)等过渡金属配合物的stokes位移大，可避免发射光谱和激发光谱的重叠；发光寿命长，可通过时间分辨荧光模式消除背景荧光的干扰；光学和热力学稳定性强，适用于原位分析。

29、(2)相比于烷基链和生育酚，选用胆固醇作为细胞膜靶向基团，胆固醇特殊的刚性结构有利于其长期标记在细胞膜上，探针可在细胞膜上保持120分钟不内化。细胞成像结果显示，仅需5分钟的孵育时间就能够实现探针对细胞膜的成像，同时具有良好的抗渗透性，优于现有的细胞膜商用染料。

技术特征：

1.用于细胞膜成像的磷光探针，其特征是，所述细胞膜成像的磷光探针为以钌或铱为中心离子的配合物m-chol，m为ru或ir；其分子结构通式如下所示：

2.如权利要求1所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s1中，所述4,4-二甲基-2,2-联吡啶、二氧化硒的物质的量摩尔比为1:1.6。

4.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s2中，所述式1、硝酸银、氢氧化钠的物质的量摩尔比为1:1:3.75。

5.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s3中，所述式3、胆固醇、三乙胺的物质的量摩尔比为1:1:3。

6.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s4中，所述三氯化钌、联吡啶的物质的量摩尔比为1:2。

7.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s5中，所述三氯化铱、苯基吡啶的物质的量摩尔比为1:2。

8.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s1中，回流温度为106℃；步骤s3中，回流温度为80℃；步骤s6中，所述式4、式5的物质的量摩尔比为1:1；所述式4、式6的物质的量摩尔比为2:1。

9.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法，其特征是，步骤s2中，所述乙醇、去离子水的体积比为1.6:1；步骤s5中，所述乙二醇、去离子水的体积比为3:1。

10.如权利要求2-9所述的任一项所述的用于细胞膜成像的磷光探针的合成方法制备的用于细胞膜成像的磷光探针在标记细胞膜中的应用。

技术总结
本发明属于分子探针技术领域，具体涉及用于细胞膜成像的磷光探针及其制备方法和应用。所述细胞膜成像磷光探针为M‑Chol，M为Ru或Ir，以钌或铱为中心离子的过渡金属配合物为发光团，胆固醇为细胞膜靶向基团，具有长寿命、双光子激发和良好的细胞膜靶向优势，可以弥补现有的细胞膜靶向荧光探针的不足，成为研究细胞膜形态和动态变化的有力工具。

技术研发人员：张文珠,法倩倩,高晓娜
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25