一种检测植物体内亚硝酰氢的荧光探针及其制备和应用

本发明属于化学检测。更具体地说，本发明涉及一种用于检测植物体内亚硝酰氢(hno)的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、亚硝酰氢(hno)是no经过单电子还原和质子化反应形成的衍生物，在生物领域中扮演着重要的角色，并与多种生理和病理过程密切相关。研究表明，在适当的条件下，hno能够直接由一氧化氮合酶(nos)氧化降解l-精氨酸而成，no和hno可以在超氧化物歧化酶(sod)作用下相互转化。近年来，随着人们对hno不断深入的了解，越来越多的研究结果表明，hno具有独特的生物活性和药理学应用，hno具有潜在的治疗心力衰竭的作用，具有抗炎作用，还可以抑制醛脱氢酶的活性，治疗酒精中毒，减轻缺血再灌注损伤等。在植物体内，hno被认为具有重要的生理功能，科学家发现植物活细胞内源性hno的产生，并发现了hno在植物乙烯信号通路中的新调节作用。此外，hno供体处理延缓草莓sod活性降低，抑制过氧化物酶(pod)、多酚氧化酶(ppo)活性，从而增强对超氧自由基的清除能力，减轻超氧自由基引起的伤害，延缓果实褐变腐败。因此，开发用于植物体内hno的实时、原位、动态检测的高效检测方法是十分必要的。

2、目前，已经报道了一些传统的方法来检测hno，如epr、19fnmr、ms、hplc、比色法和电化学分析。然而，这些方法操作繁琐，难以应用于生物样本的实时、原位检测分析。鉴于此，研究开发快速、灵敏、无损、原位监测植物应答逆境胁迫过程中hno的检测方法是化学与植物学的前沿领域和重要研究方向。近年来，荧光探针因具有操作较简便、灵敏度高、重现性及膜通透性好、实时原位检测、设备技术要求低等多种优点被广泛应用于生物体内活性分子的高时空分辨率成像及与其相关的生理和病理过程的传感分析。新型荧光探针的开发与利用已成为化学、生物、医学和农业等学科热点研究领域。

3、近红外(nir)荧光探针的发射波长在650-900nm，具有背景干扰小，组织穿透力强，组织损伤小等优点，可有效避免植物体内光敏物质的干扰，实现对植物内部环境中hno的水平进行实时原位监测与成像研究。然而，目前还未有用于检测植物体hno近红外荧光探针的报道，严重阻碍了植物体内hno的生理机制研究。因此，有必要构建新型近红外荧光探针用于植物体内hno高灵敏、高特异性、实时快速检测与成像，揭示逆境胁迫过程相关分子机制，实现农业可持续性发展和维护粮食安全。

技术实现思路

1、本发明提出一种基于二氰基异佛尔酮衍生物的用于植物体内亚硝酰氢(hno)检测的近红外荧光探针，其能够在复杂的样品环境中检测hno，并对hno具有高选择性和高灵敏度；本发明还提供了所述近红外荧光探针的制备方法和应用。

2、在第一个方面，本发明提供一种基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针，其结构式如下：

3、

4、上述基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针分子的合成路线为：

5、

6、在第二个方面，本发明提供了所述基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针的制备方法，包括：

7、(1)将(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、3-氯-4-羟基苯甲醛和无水乙醇的混合物在80℃下搅拌，冷却后，蒸馏除去溶剂，粗产物用柱层析纯化得到红色固体，即为化合物1；

8、(2)将2-(二苯基膦)苯甲酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷中，室温搅拌，然后加入化合物1，室温搅拌，反应完成后，将反应液中倒入水中，萃取，将有机相蒸馏除去溶剂，粗产物用柱层析纯化得到黄色固体，即为所述荧光探针。

9、在一些实施方式中，步骤(1)中，(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈和3-氯-4-羟基苯甲醛的摩尔比为1:(1.2-2)。

10、在一些实施方式中，步骤(1)中，混合物搅拌6-24小时。

11、在一些实施方式中，步骤(1)中，柱层析纯化所用洗脱液为二氯甲烷和甲醇，体积比为(100-20)：1。

12、步骤(1)中化合物1的产率为40％-60％。

13、在一些实施方式中，步骤(2)中，2-(二苯基膦)苯甲酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1.2-5):(0.1-0.5)。

14、在一些实施方式中，步骤(2)中，加入化合物1前的搅拌时间为0.5-1小时。

15、在一些实施方式中，步骤(2)中，加入化合物1后的搅拌时间为6-24小时。

16、在一些实施方式中，步骤(2)中，柱层析纯化所用洗脱液为石油醚和乙酸乙酯，体积比为(2-6)：1。

17、步骤(2)中，所述荧光探针lf的产率为50％-70％。

18、在第三个方面，本发明提供了所述基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针在检测植物体内亚硝酰氢中的应用。

19、本发明具有以下有益效果：

20、(1)本发明的荧光探针lf结构新颖，合成方法简单且易分离提纯，能够对hno实现专一性识别，克服常见活性小分子的干扰，还能够对hno实现高灵敏性识别，最低检出限为97.0nm。

21、(2)本发明的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针lf识别hno的机理如图1所示

22、本发明所选用的荧光团二氰基异佛尔酮衍生物分子结构具有制备简便、光稳定性高、发射波长长、量子产率高、斯托克斯位移大等优点。2-(二苯基膦基)-苯甲酸酯可与hno发生特异性反应，将该基团引入到二氰基异佛尔酮荧光团中用于响应hno。本发明的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针lf结构中，通过2-(二苯基膦基)-苯甲酸酯阻断分子内电荷转移(ict)过程，探针lf荧光完全猝灭。加入hno后，2-(二苯基膦)-苯甲酸酯基团可以被准确识别并快速生成相应的氮杂环，随后邻酯的分子间攻击释放探针与hno反应后的荧光团，荧光团分子内电荷转移(ict)过程恢复，显示出强烈的荧光发射。

23、(3)本发明的探针识别hno后荧光发射波长在近红外光区内、斯托克斯位移大(130nm)，使得本发明的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等诸多优点，通过共聚焦显微镜，本发明的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针可成功用于植物体内hno的成像与检测。

技术特征：

1.一种基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针，其结构式如下：

2.权利要求1所述的二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针的制备方法，包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(1)中，(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈和3-氯-4-羟基苯甲醛的摩尔比为1:(1.2-2)。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(1)中，混合物搅拌6-24小时。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(1)中，柱层析纯化所用洗脱液为二氯甲烷和甲醇，体积比为(100-20)：1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(2)中，2-(二苯基膦)苯甲酸、1,3-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:(1.2-5):(0.1-0.5)。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(2)中，加入化合物1前的搅拌时间为0.5-1小时。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(2)中，加入化合物1后的搅拌时间为6-24小时。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其中，步骤(2)中，柱层析纯化所用洗脱液为石油醚和乙酸乙酯，体积比为(2-6)：1。

10.权利要求1所述的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针或由权利要求2-9中任一项所述的制备方法获得的基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针在检测植物体内亚硝酰氢中的应用。

技术总结
本发明属于化学检测领域，涉及植物体内亚硝酰氢（HNO）的检测，特别是基于二氰基异佛尔酮衍生物的近红外荧光探针及其制备方法和应用。本发明制备的荧光探针（LF）由于分子内电荷转移过程被阻断，本身在溶液体系中无荧光发射；当与亚硝酰氢发生特异性反应后，荧光团被释放，ICT过程恢复，溶液体系具有显著荧光增强。本发明的探针LF对HNO的检测具有高灵敏度、优异的选择性、响应时间快以及斯托克斯位移大等优点。通过共聚焦显微镜，探针LF成功用于植物体内HNO的成像与检测，具有较好的应用价值。

技术研发人员：杨晓朋,姬小明,罗菲,张士怡
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25