报告基因结合叶绿素荧光参数NPQ的启动子活性分析方法

本发明属于植物生物，具体涉及报告基因结合叶绿素荧光参数npq的启动子活性分析方法。

背景技术：

1、在植物功能基因研究中，基因启动子研究分析是重要的组成部分，因而对启动子的活性及功能研究至关重要。常规植物启动子活性分析的方法是通过转基因技术获得稳定的转基因株系，使用gus或者荧光蛋白作为报告基因，通过gus染色深浅或检测荧光强度来判断启动子活性的强弱，此类技术实验周期长、无法做到实时有效监测、工作量大、成本高。

2、植物吸收的光能有3个去向光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒1＝光合作用+叶绿素荧光+热。可以得出叶绿素荧光＝1-光合作用-热，即叶绿素荧光产量的下降可能是由于光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭(qp)，而由热耗散引起的荧光淬灭，其可以通过叶绿素荧光参数非光化学淬灭(npq)来计算。

3、热耗散是依赖于叶黄素循环的植物耗散过剩光能避免光抑制发生的重要途径之一，而vde是叶黄素循环中的关键酶，vde的缺失或其活性受到抑制都会影响npq。

4、psbs蛋白主要存在于高等植物中，是快速诱导npq所必需的。在强光下，植物类囊体内腔酸化，psbs在感应类囊体内腔酸化后诱发一种非常有效的高光保护机制，即为能量依赖性淬灭(qe)，而qe在高等植物中是npq的主要部分。

5、目前研究表明，过量或抑制植物psbs和vde基因表达均可以改变植物叶片的npq能力。调制叶绿素荧光技术是目前分析植物叶绿素荧光最简便有效的技术，能有效快速的测定叶绿素荧光参数npq等。因此，本发明提供一种报告基因结合叶绿素荧光参数npq的启动子活性检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种将植物vde或psbs基因作为报告基因结合叶绿素荧光参数npq分析的启动子活性检测方法以改善常规植物启动子活性分析方法中存在的实验周期长、无法做到实时有效监测、工作量大、成本高等问题。

2、一方面，本发明提供的一种将植物vde或psbs基因作为报告基因结合叶绿素荧光参数npq分析的启动子活性检测方法，包括以下步骤：

3、插入报告基因反义片段构建启动子报告载体；所述报告基因包括植物vde基因、psbs基因；

4、将待测启动子片段插入所述启动子报告载体中构建待测启动子载体；

5、将所述待测启动子载体经过遗传转化、筛选，得到转基因植株；

6、对所述转基因植株进行植物叶绿素荧光参数npq的测定，获得待测启动子的活性。

7、可选地，插入报告基因反义片段构建启动子报告载体步骤中，所述报告基因反义片段通过克隆获得。

8、可选地，将所述待测启动子载体经过遗传转化、筛选，得到转基因植株，所述遗传转化的方法包括农杆菌介导的花浸泡法。

9、可选地，将所述待测启动子载体经过遗传转化、筛选，得到转基因植株，所述筛选需筛选至转基因植株的t3代。

10、另一方面，本发明提供一种将植物vde或psbs基因作为报告基因结合叶绿体荧光参数npq的通过瞬时表达分析启动子活性的方法，包括以下步骤：

11、插入报告基因反义片段构建启动子报告载体；

12、将所述启动子报告载体经过农杆菌导入植株叶片中进行瞬时表达；对所述植株叶片进行叶绿素荧光参数的测定，获得待测启动子的动态活性；所述叶绿素荧光参数包括非光化学淬灭。

13、可选地，所述植株包括烟草。

14、第三方面，本发明提供一种报告基因结合叶绿素荧光参数npq的启动子活性检测方法在定量化检测启动子活性中的应用。

15、本发明具备的有益效果包括：

16、(1)本发明提供的方法能够快速通过叶绿素荧光参数npq来分析启动子活性强弱，同时具备精细定量化检测启动子活性，缩短实验周期，降低实验成本等优点；

17、(2)本发明提供的方法在启动子瞬时表达分析中，可通过实时监测叶绿素荧光参数npq变化，分析启动子活性动态变化，同时能够减少实验中的工作量。

技术特征：

1.一种报告基因结合叶绿素荧光参数npq的启动子活性分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述待测启动子载体经过遗传转化、筛选，得到转基因植株，所述遗传转化的方法包括农杆菌介导的花浸泡法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述待测启动子载体经过遗传转化、筛选，得到转基因植株，所述筛选包括筛选至转基因植株的t3代。

4.一种报告基因结合叶绿体荧光参数npq的通过瞬时表达分析启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述待测启动子载体经过农杆菌导入植株叶片中进行瞬时表达，所述植株包括烟草。

6.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，插入报告基因反义片段构建启动子报告载体步骤中，所述报告基因反义片段通过克隆获得。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法在定量化检测启动子活性中的应用。

技术总结
本发明提供了一种将植物VDE或PsbS基因作为报告基因结合叶绿素荧光参数NPQ分析启动子活性的检测方法；通过以PsbS和VDE基因中至少一种作为报告基因构建待测启动子载体，通过瞬时表达或遗传转化，并结合叶绿素荧光成像仪对叶绿素荧光参数NPQ进行测定，通过叶绿素荧光参数NPQ来分析待测启动子的活性；也可通过实时监测叶绿素荧光参数NPQ变化，分析待测启动子活性变化；本发明提供的方法操作简便、启动子活性强弱鉴别简单方便，可定量化检测启动子活性，同时能够分析启动子活性动态变化，缩短实验周期，降低实验成本，具有良好的应用前景。

技术研发人员：娄永峰,肖复明,宋晓琛,冷春晖,陈兴彬
受保护的技术使用者：江西省林业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4