一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用。

背景技术：

1、葡萄糖氧化酶(gox，ec 1.1.3.4)是一种含有紧密非共价结合辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(fad，wang，sun，qiao，ouyang，&na，2017)的黄蛋白。在催化反应中，fad作为氧化还原载体，而gox以分子氧为电子受体，催化β-d-葡萄糖氧化为d-葡萄糖-δ-内酯和过氧化氢。由于这些特殊的性质，基于gox的应用被广泛应用于化学、食品、饮料、制药和临床行业。这些应用包括用于临床和环境监测的葡萄糖传感器，食品工业中的氧化剂和葡萄糖酸生产。这些过程中使用的酶必须至少满足三个重要标准：高特异性，催化效率和稳定性。因此，为了鉴定或开发具有商业价值的酶，进行了一系列的研究，包括通过蛋白质工程方法提高酶的稳定性和催化活性。

2、通过定向进化和理性设计来改善酶的热稳定性是可行的。非理性设计策略不需要了解蛋白质的结构与功能的特点，但是必须具备一个高通量定向筛选突变体的方法，并且该方法的工作量较大，造成大量的人力和资金的消耗。随着蛋白质结构和功能鉴定技术的日渐成熟，人们对蛋白质结构的研究越来越深入，基于理性设计对蛋白质进行分子改良的策略发展起来。这一蛋白质工程技术的发展同样也离不开对酶蛋白稳定性的了解，然而，热稳定性的机制是复杂的。虽然已经采用了许多有效的方法，如二硫键、氢键和疏水相互作用策略，目前改良的成果虽然明显，但依然未满足于工业需求。

3、近年来计算机辅助设计技术被应用于酶的催化性能改造，并取得瞩目的成绩。蛋白质结构是酶分子中这些因素的综合作用，这些力量的任何变化都可能导致稳定性的变化。其中，蛋白质自由展开能(δg)是衡量蛋白质热力学稳定性的重要参数之一，也是衡量蛋白质热稳定性的主要指标。突变对蛋白质热稳定性的影响可以通过计算蛋白质突变后δg值(δδg)的变化来确定，可以借助计算机模拟来预测。分子动力学模拟已被用于鉴定可能导致δg显着差异的有价值的残基。例如，使用这种策略，ochrobactrum的甲基对硫硫水解酶和candidaantarctica的脂肪酶b的热稳定性得到了显著改善，与野生型相比，突变酶的一半蛋白质分子变性(tm)的温度分别提高了11.7℃和3.6℃。然而，目前的大多数改造旨在提高酶的热稳定性导致活性降低而不是增加活性。因此，当通过蛋白质工程提高酶的稳定性时，保持酶的活性至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明通过计算机辅助模拟设计，进行改造靶点打分，获得高比活耐热突变体gox1_p514k，该突变体具有高比活和强抗菌性能，表现出巨大的应用前景。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k，所述葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明还提供编码所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的核酸，所述核酸的序列如seq id no.4所示。

5、本发明还提供一种包含所述的核酸的生物材料。

6、进一步地，所述生物材料包括重组载体或重组菌。

7、进一步地，所述重组载体的骨架载体为ppic9k质粒。

8、进一步地，所述重组菌的基础菌株为毕赤酵母gs115。

9、本发明还提供所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k或所述的生物材料在制备抗菌剂或食品保鲜剂中的应用。

10、进一步地，所述抗菌剂用于抑制金黄色葡萄球菌。

11、本发明还提供一种抗菌剂，有效成分包括所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k。

12、本发明还提供所述的抗菌剂的制备方法，包括利用上述的生物材料获得所述葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的步骤。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明以来源于曲霉的葡萄糖氧化酶gox1为母本，通过定点突变方式，将如seqid no.1所示序列的第514位由pro突变为lys，得到一种突变体。具体方法为通过构建含有该突变体的重组菌株，诱导培养后筛选出高比活的一种葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k。在催化活力方面，突变体gox1_p514k的比活为110.8u/mg，比野生型(33.7u/mg)提高了2.3倍；在稳定性方面，突变体gox1_p514k的t50值为69℃，较野生型(60℃)提高9℃；突变体gox1_p514k在75℃下半衰期(t1/2)为25min，较野生酶gox1(6min)延长19min；最适ph值和最适温度与野生型基本一致。

15、本发明通过计算机辅助模拟设计，进行改造靶点打分，获得高比活耐热突变体gox1_p514k，该突变体具有高比活和强抗菌性能，表现出巨大的应用前景。

技术特征：

1.一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如seq id no.4所示。

3.一种包含权利要求3所述的核酸的生物材料。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组载体或重组菌。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体的骨架载体为ppic9k质粒。

6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组菌的基础菌株为毕赤酵母gs115。

7.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k或权利要求3～6任一项所述的生物材料在制备抗菌剂或食品保鲜剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂用于抑制金黄色葡萄球菌。

9.一种抗菌剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k。

10.如权利要求9所述的抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括利用权利要求3～6任一项所述的生物材料获得所述葡萄糖氧化酶突变体gox1_p514k的步骤。

技术总结
本发明公开了一种具有高抑菌性的耐热葡萄糖氧化酶突变体及其应用，属于基因工程领域。所述葡萄糖氧化酶突变体GOX1_P514K的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以来源于曲霉的葡萄糖氧化酶GOX1为母本，通过定点突变方式，将如SEQ ID NO.1所示序列的第514位由脯氨酸(Pro)突变为赖氨酸(Lys)，获得的高比活耐热突变体GOX1_P514K。该突变体在催化活力和热稳定性方面显著优于野生型葡萄糖氧化酶GOX1。同时该突变体具有高比活和强抗菌性能，表现出巨大的应用前景。

技术研发人员：李婧,何晓晓,何建强,周燕
受保护的技术使用者：江苏大学附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29