一株控制辣椒软腐病的拮抗乳酸菌及其应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一株控制辣椒软腐病的拮抗乳酸菌及其应用。

背景技术：

1、辣椒营养丰富，脂肪含量低，维生素c含量居蔬菜之首。我国辣椒产量居世界之首，辣椒年产量超过6000万吨，其中鲜食辣椒约2800万吨，同时，我国也是辣椒消费大国，辣椒已成为人们餐桌上不可或缺的蔬菜，并且周年食用。

2、然而，辣椒的生长具有明显的季节性，需要通过贮藏或者南菜北运在全国实现鲜食辣椒周年供应，但是，鲜食辣椒在贮运过程中易发生腐烂，每年微生物引起的采后损失占辣椒总产量10％-50％，其中，由果胶杆菌引起的软腐病是新鲜辣椒贮运过程中最主要的病害，发病的辣椒果实最开始变成水浸状，然后变为褐色、软、黏滑、伴有恶臭味，最后整个果实腐烂收缩并伴有脓水，腐烂辣椒汁液污染其他健康辣椒后，健康辣椒3-5天内即会完全腐烂，从而影响了鲜食辣椒正常的贮运工作。因此，降低辣椒采后腐烂具有重要的经济意义，但是，针对辣椒采后软腐病，目前尚无安全、有效的控制方法。

3、随着消费者对天然食品需求的增强，对化学农药或化学防腐剂越来越排斥，利用生物防治技术进行蔬菜采后贮藏保鲜已成为国内外研究者的共识。生物防治技术已成为我国农业绿色防控、保障食品安全的重要战略技术。乳酸菌是一类食品级微生物，在食品发酵、保鲜等领域的应用历史已超过5000年。我国农药网目前已登记的用来控制由果胶杆菌引起的蔬菜软腐病的拮抗菌有7株，包括6株枯草芽孢杆菌和1株解淀粉芽孢杆菌。然而，目前尚无控制蔬菜软腐病拮抗乳酸菌菌株登记和商业化应用。

4、因此，怎样提供一株控制辣椒软腐病的拮抗乳酸菌及其应用，成为了本领域技术人员有待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一株来自传统发酵食品的具有抑制果胶杆菌活性的拮抗乳酸菌；目的之二在于提供该拮抗乳酸菌及其细菌素在制备防治辣椒软腐病的产品中的应用。

2、经研究，本发明提供如下技术方案：

3、1、拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037，保藏编号为cgmccno.27631。

4、本发明的拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037是从四川省内江市一个市民家庭自制泡菜中分离得到的，于2023年6月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmcc no.27631，分类命名为肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)。

5、2、拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037菌体产品的制备：

6、将拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037种子菌接种于mrs液体培养基中培养，在37℃下培养24-72h，培养后离心，离心后收集菌体并重新悬浮于无菌生理盐水至菌体浓度为od600nm＝0.1-1.0，即得拮抗乳酸菌菌体悬浮液。

7、3、一种新型细菌素fp-41，该细菌素为上述拮抗乳酸菌(leuconostocmesenteroides)snp037所产，其氨基酸序列为fpllpivvpiiaggatyvakdawnhldqirsgwrkagnskw。

8、4、基于拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037原位表达的细菌素产品的制备：

9、将拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037种子菌以0.1-1wt％接种于mrs液体培养基中，在30℃下培养24-72h，培养后进行离心(6000rpm、4℃离心10min)，离心后，收集上清液，并加入硫酸铵至80％饱和度，然后在4℃环境下过夜沉淀，沉淀后进行离心(12000rpm、4℃离心15min)，最后收集沉淀，即得细菌素样品。

10、5、基于大肠杆菌bl21异源表达的细菌素产品的制备：

11、提取拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037的基因组dna，以基因组dna为模板，以snp037-f(5′-gaaggagatatacatatgtttccactattgccaattg-3′)和snp037-r(5′-tggtgctcgagttaccacttactattacctg-3′)为引物，进行pcr扩增，以获得细菌素的编码基因。

12、pcr扩增产物和表达载体pet-30a(+)用和消化，且用t4连接酶连接，其次，将含有细菌素基因的重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss感受态细胞中，然后，将含有细菌素基因的大肠杆菌bl21接种于含有0.8mg/ml浓度卡那霉素的100ml lb肉汤中，在37℃下以100rpm将其培养至od600nm为0.6，接下来，加入0.4mm浓度的iptg，在16℃下以100rpm过夜诱导细菌素表达，离心(4000rpm，4℃，20min)后收集细胞，并用无菌水清洗三次以去除残留的卡那霉素，最后，将细胞重悬于无菌水中，以6-12次冻融破坏细胞，破坏后将菌悬液在80℃下加热30min，加热后，离心(12,000rpm，4℃，20min)收集上清液(0.5ml)，最后经0.22μm的微孔滤膜过滤后，即得细菌素样品。

13、6、拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037或其菌悬液或其含菌发酵液在制备防治辣椒软腐病的产品中的应用。

14、进一步，所述辣椒细菌性软腐病由果胶杆菌所引起。

15、7、拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037所产细菌素在制备防治辣椒软腐病的产品中的应用。

16、进一步，所述辣椒细菌性软腐病由果胶杆菌所引起。

17、本发明的有益效果是：

18、本发明公开了保藏编号为cgmcc no.27631的拮抗乳酸菌(leuconostocmesenteroides)snp037，其菌体及所产细菌素对软腐病原菌具有较强抑菌活性，菌体的抗辣椒软腐病活性强于商业化拮抗菌枯草芽孢杆菌r1，显著降低辣椒果实的软腐病发病率、病斑直径，减少辣椒在贮运期间的腐烂损失，同时本发明在辣椒软腐病的生物防治方面具有良好的应用潜力，且也为研发微生物防腐剂提供了优良的基础菌株，并且为生物防腐剂提供了新型细菌素资源，有利于推广。

技术特征：

1.拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037，保藏编号为cgmccno.27631。

2.权利要求1所述拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037菌体的制备，其特征在于，菌悬液的浓度为od600nm＝0.1-1。

3.权利要求1所述拮抗乳酸菌(leuconostoc mesenteroides)snp037所产细菌素fp-41，其特征在于，氨基酸序列为fpllpivvpiiaggatyvakdawnhldqirsgwrkagnskw。

4.权利要求3所述细菌素的原位制备，其特征在于，将拮抗乳酸菌(leuconostocmesenteroides)snp037种子菌以0.1-1wt％接种于mrs液体培养基中，然后进行离心，离心后收集上清液，并加入硫酸铵至80％饱和度，接下来，将上清液过夜沉淀后再次进行离心，最后，收集沉淀，即得细菌素样品。

5.权利要求3所述细菌素的异源制备，其特征在于，以拮抗乳酸菌(leuconostocmesenteroides)snp037的基因组dna为模板，以snp037-f(5′-gaaggagatatacatatgtttccactattgccaattg-3′)和snp037-r(5′-tggtgctcgagttaccacttactattacctg-3′)为引物，进行pcr扩增，以获得细菌素的编码基因；pcr扩增产物和表达载体pet-30a(+)连接后的重组质粒转化到大肠杆菌bl21中；将含有细菌素基因的大肠杆菌bl21在卡那霉素和iptg下诱导表达，离心洗涤菌体后重悬于无菌水中，以冻融破坏细胞；离心收集上清液，经微孔滤膜过滤后，即得细菌素样品。

6.权利要求2所述菌体在制备防治辣椒软腐病的产品中的应用。

7.权利要求3至5任一项所述的细菌素在制备防治辣椒软腐病的产品中的应用。

8.如权利要求6至7任一项所述的应用，其特征在于，所述辣椒软腐病由果胶杆菌(pectobacterium carotovorum)所引起。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株控制辣椒软腐病的拮抗乳酸菌及其应用；本发明公开了保藏编号为CGMCC No.27631的拮抗乳酸菌(Leuconostoc mesenteroides)SNP037，该拮抗乳酸菌能够降低辣椒软腐病的发病率和病斑直径，且拮抗乳酸菌(Leuconostoc mesenteroides)SNP037对辣椒软腐病的控病活性强于商业化拮抗菌枯草芽孢杆菌R1，并且拮抗乳酸菌(Leuconostoc mesenteroides)SNP037能够产生新型细菌素FP‑41，同时该细菌素对软腐病原菌果胶杆菌具有抑菌活性；本发明不仅为辣椒软腐病生物防治提供了一株优良菌株，同时还为辣椒软腐病控制提供了一种新型生物防腐剂细菌素。

技术研发人员：易兰花,唐冀韬,曾凯芳,阮长晴,邓丽莉,姚世响,王文军,陈祈
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7