多功能基因修饰载体及其制备的多功能基因修饰免疫细胞和它们的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地，本发明涉及多功能基因修饰载体及其制备的多功能基因修饰免疫细胞和它们的应用。更具体地，本发明涉及一种shrna、分离的核酸、试剂盒、转基因免疫细胞、药物组合物、一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法及其用途。

背景技术：

1、基因修饰细胞疗法是一种新型的治疗方法，通过修改患者体内细胞的基因组来治疗疾病。该技术利用基因工程技术将外源基因或调控因子导入免疫细胞中，赋予这些免疫细胞新的功能或更强的治疗潜力。基因修饰细胞技术广泛应用于nk细胞、t细胞、nkt细胞、γδt细胞和巨噬细胞等用于免疫治疗的免疫细胞。

2、肿瘤通常具有纤维组织的物理屏障，屏障内存在低氧、低ph、营养缺乏和高渗透压等肿瘤微环境，并且缺乏成熟的血管供应。因此，肿瘤内的微环境对于免疫细胞在瘤内定位、浸润、存活和增殖十分不利，并且易导致免疫抑制和免疫耗竭。

3、因此，亟需进一步开发新的基因修饰免疫细胞，以提高免疫细胞在肿瘤中的存活、细胞增殖、抵抗免疫耗竭和提高肿瘤内浸润能力。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

2、本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

3、发明人意外发现nk细胞的体内扩增与持久性弱、肿瘤内浸润能力差与易发生免疫耗竭或免疫抑制，发明人构建了一种表达沉默免疫抑制性受体tigit的shrna、细胞膜表达的il15/il15rα融合蛋白与趋化因子受体cxcr2的多功能基因修饰载体，用于修饰nk细胞。经本发明多功能基因修饰载体修饰的nk细胞，可以增强其在肿瘤中的存活周期与细胞增殖能力、抵抗免疫耗竭与提高肿瘤内浸润的能力，从而进一步提高其在临床中的疗效。

4、基于此，本发明的第一个方面，本发明提出了一种shrna。根据本发明的实施例，所述shrna包括seq id no:7～seq id no:11任一项所示的核苷酸序列。根据本发明实施例的shrna，可抑制免疫细胞上tigit分子的表达，增强免疫细胞对tigit受体配体cd155高表达肿瘤的杀伤效率，进而增强免疫细胞的浸润能力和免疫细胞的抗肿瘤活性。

5、在本发明的第二个方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸包括第一核酸分子，第一核酸分子抑制tigit的表达；第二核酸分子，所述第二核酸分子编码融合蛋白，融合蛋白包括il-15rα和il-15；以及第三核酸分子，第三核酸分子编码cxcr2；其中，所述第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子相连。根据本发明实施例分离的核酸，可抑制免疫细胞上tigit分子的表达，以及可使免疫细胞膜表达il15/il15rα融合蛋白和cxcr2受体，可提高携带上述分离的核酸的免疫细胞在体内外长期存活和扩增能力、及其在肿瘤内的浸润能力和抗肿瘤活性。

6、在本发明的第三个方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带本发明的第二个方面所述的分离的核酸。根据本发明实施例的表达载体可制备转基因免疫细胞，该转基因免疫细胞杀伤肿瘤效率高、抗肿瘤活性强、在体内外存活时间长、扩增能力强以及在肿瘤内浸润能力强。

7、在本发明的第四个方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括本发明的第二个方面所述的分离的核酸或本发明的第三个方面所述的表达载体。根据本发明实施例的试剂盒可制备转基因免疫细胞，该转基因免疫细胞杀伤肿瘤效率高、抗肿瘤活性强、在体内外存活时间长、扩增能力强以及在肿瘤内浸润能力强。

8、在本发明的第五个方面，本发明提出了一种转基因免疫细胞。根据本发明的实施例，所述转基因免疫细胞抑制tigit的表达，以及表达融合蛋白和cxcr2；其中，所述融合蛋白包括il-15rα和il-15。该转基因免疫细胞具有对肿瘤的杀伤效率高、抗肿瘤活性强、在体内的长期存活和扩增能力强以及增殖与趋化能力强等优点。

9、在本发明的第六个方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括本发明的第二个方面所述的分离的核酸、本发明的第三个方面所述的表达载体、本发明的第五个方面所述的转基因免疫细胞。根据本发明实施例的药物组合物对肿瘤的杀伤效率高、抗肿瘤活性强、在体内外长期存活和扩增能力以及增殖与趋化能力强。

10、在本发明的第七个方面，本发明提出了一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将本发明的第三个方面所述的表达载体或本发明的第四个方面所述的试剂盒中的表达载体导入免疫细胞；将导入表达载体的免疫细胞进行培养。该方法可增强免疫细胞的杀伤效率、增强免疫细胞的抗肿瘤活性、提高免疫细胞在体内外长期存活和扩增能力以及增殖与趋化能力，尤其是可在体外制备得到杀伤、活化、增殖与趋化强的免疫细胞，用于构建所需的免疫细胞模型。

11、在本发明的第八个方面，本发明提出了本发明的第二个方面所述的分离的核酸、本发明的第三个方面所述的表达载体、本发明的第五个方面所述的转基因免疫细胞、本发明的第六个方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。

12、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种shrna，其特征在于，包括seq id no:7～seq id no:11任一项所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的shrna，其特征在于，所述shrna具有如seq id no:7所示的核苷酸序列；

3.一种分离的核酸，其特征在于，包括：

4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其特征在于，所述第一核酸分子携带权利要求1～2任一项所述的shrna；

5.根据权利要求4所述的分离的核酸，其特征在于，所述第二核酸分子和第三核酸分子相连，所述第一核酸分子位于所述第二核酸分子和第三核酸分子的其中一端；

6.根据权利要求5所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸从5’端到3’端依次为第一核酸分子、第五核酸分子、第二核酸分子、第四核酸分子、第三核酸分子、第六核酸分子；或者

7.一种表达载体，所述表达载体携带权利要求3～6任一项所述的分离的核酸；

8.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求3～6任一项所述的分离的核酸或权利要求7所述的表达载体。

9.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述转基因免疫细胞抑制tigit的表达，以及表达融合蛋白和cxcr2；

10.据权利要求9所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述tigit具有如seq id no:1所示的氨基酸序列；

11.一种药物组合物，其特征在于，包括：

12.一种增强免疫细胞杀伤、活化、增殖与趋化的方法，其特征在于，包括：

13.权利要求3～6任一项所述的分离的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求9～10任一项所述的转基因免疫细胞或权利要求11所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤；

技术总结
本发明公开了一种多功能基因修饰载体及其制备的多功能基因修饰免疫细胞和它们的应用。所述多功能基因修饰载体携带分离的核酸，分离的核酸包括：抑制TIGIT的表达的第一核酸分子；编码融合蛋白的第二核酸分子，融合蛋白包括IL‑15Rα和IL‑15；以及编码CXCR2的第三核酸分子；其中，第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子相连。该多功能基因修饰载体可在宿主细胞中抑制TIGIT的表达、以及表达包括IL‑15Rα和IL‑15的融合蛋白和CXCR2，由此，采用该多功能基因修饰载体制备的多功能基因修饰免疫细胞可提高其存活能力、增殖能力和肿瘤内浸润能力，还可以抵抗免疫耗竭，从而进一步提高免疫细胞的临床疗效。

技术研发人员：胡渊,王烃,周英利,张彩,陈敏华,谢思奇
受保护的技术使用者：上海恩凯细胞技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25